Name: in ovo expression of microrna in ventral chick midbrain
Uploaded: 2013-09-16T07:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain at JoVE.com

Reconocemos K. Mikic, que contribuyó a la fase inicial de esta película y M. Nicolescu para la imagen MIR. C. Huber fue apoyado por una beca de la IZKF del Universtitätsklinikum Tübingen, A. Alwin Prem Anand por el programa de la fortuna del Universtitätsklinikum Tübingen.

1. Requisitos para la electroporación in ovo <ol><li> Preparación de la construcción del vector: sentido y antisentido mir primers fueron diseñados después de las instrucciones de Ambion, recocidas y se ligaron en ApaI / EcoRI digerido pSilencer pSilencer U6.1 vector. Después de la transformación con éxito uno de los clones resultantes se cultivó y el plásmido pSilencer pSilencer se aisló por el método de lisis alcalina utilizando un kit de preparación de MIDI Quiagen. </li><li> ...

<ol>
	<li>Kutter, C., Svoboda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA,+siRNA,+piRNA:+Knowns+of+the+unknown.">miRNA, siRNA, piRNA: Knowns of the unknown.</a> RNA Biol. 5, 181-188 (2008).</li><li>Szell, M., Bata-Csorgo, Z., Kemeny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enigmatic+world+of+mRNA-like+ncRNAs:+their+role+in+human+evolution+and+in+human+diseases.">The enigmatic world of mRNA-like ncRNAs: their role in human evolution and in human diseases.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 141-148 (2008).</li><li>Li, X., Jin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+small+regulatory+RNAs+in+determining+neuronal+identity.">Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity.</a> Nature reviews. Neuroscience. 11, 329-338 (2010).</li><li>Riedmann, L. T., Schwentner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA,+siRNA,+piRNA+and+argonautes:+news+in+small+matters.">miRNA, siRNA, piRNA and argonautes: news in small matters.</a> RNA Biol. 7, 133-139 (2010).</li><li>Coolen, M., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+brain+development+and+physiology.">MicroRNAs in brain development and physiology.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19, 461-470 (2009).</li><li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).</li><li>Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shocking'+developments+in+chick+embryology:+electroporation+and+in+ovo+gene+expression.">Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).</li><li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+gene+expression+in+chick+embryos+by+microelectroporation.">Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation.</a> Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).</li><li>Nakamura, H., Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misexpression+of+genes+in+brain+vesicles+by+in+ovo+electroporation.">Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 42, 199-201 (2000).</li><li>Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+temporally+controlled+electroporation+of+early+chick+embryos.">Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos.</a> Nat. Protoc. 3, 419-426 (2008).</li><li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Gene Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> The EMBO journal. 1, 841-845 (1982).</li><li>Potter, H., Weir, L., Leder, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer-dependent+expression+of+human+kappa+immunoglobulin+genes+introduced+into+mouse+pre-B+lymphocytes+by+electroporation.">Enhancer-dependent expression of human kappa immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 7161-7165 (1984).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function.">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Dev. Dyn. 229, 433-439 (2004).</li><li>Canto-Soler, M. V., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+cup+and+lens+development+requires+Pax6+expression+in+the+early+optic+vesicle+during+a+narrow+time+window.">Optic cup and lens development requires Pax6 expression in the early optic vesicle during a narrow time window.</a> Developmental biology. , 294-2119 (2006).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951.">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Dev Dyn. 195, 231-272 (1992).</li><li>Muramatsu, T., Nakamura, A., Park, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation:+a+powerful+and+convenient+means+of+nonviral+gene+transfer+to+tissues+of+living+animals+(Review).">In vivo electroporation: a powerful and convenient means of nonviral gene transfer to tissues of living animals (Review).</a> Int J Mol Med. 1, 55-62 (1998).</li><li>Agoston, Z., Li, N., Haslinger, A., Wizenmann, A., Schulte, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+physical+interaction+of+Meis2,+Pax3+and+Pax7+during+dorsal+midbrain+development.">Genetic and physical interaction of Meis2, Pax3 and Pax7 during dorsal midbrain development.</a> BMC Dev Biol. 12, 10 (2012).</li><li>De Pietri Tonelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+detection+of+microRNAs+in+developing+vertebrate+embryos+after+acute+administration+of+a+dual-fluorescence+reporter/sensor+plasmid.">Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid.</a> Biotechniques. 41, 727-732 (2006).</li></ol>

Este video muestra un método eficaz para transfectar plásmido en las células neuroepiteliales de áreas específicas del cerebro medio pollito. Pulsos eléctricos rectangulares de baja tensión pueden introducir ADN en las células del tubo neural de pollo in ovo 6,16. Sin embargo, la exactitud de la focalización de ADN a menudo se ve obstaculizada por el campo eléctrico de ancho, que se eleva a través de los electrodos relativamente grandes (Φ = 0,5 mm). Hemos tratado de hacer frente a ese pr...

El reconocimiento de los ARN no codificantes pequeños como reproductores adicionales para la expresión de genes lanzó una nueva complejidad a la regulación genómica de programación / gen. Las diferentes especies de RNAs no codificantes tienen importancia funcional en las células neuronales, incluidos los pequeños no codificante RNAs 1-4. Los microARN (miR o miARN), por ejemplo, muestran distintos perfiles de expresión y los cambios en los cerebros en desarrollo 5. Dirigida en la electroporación in ovo de embriones de pollo ofrece una oportunidad única para el control temporal y espacial de la expresión génica y el silenciamiento durante el desarrollo. Este video muestra las diferentes etapas de realizar la expresión ectópica de MIR en áreas específicas del cerebro medio pollito utilizando electroporación in ovo 6-10. Para garantizar un efecto de larga duración de estos pequeños RNAs no codificantes en las células, la secuencia de ADN del MIR fueron clonados en vectores de mono o bi-cistrónicos. Porque en la electroporación in ovo, MIR contiene vEctor se inyecta en el tubo neural del cerebro medio exponiendo el embrión después de hacer una pequeña ventana en la cáscara del huevo. Para transfectar áreas específicas del cerebro medio, más pequeño (ánodo) y negativo (cátodo) electrodos de platino se colocan en posiciones específicas. Para la transfección cerebro medio ventral, el ánodo se coloca debajo de la mesencéfalo ventral izquierda y el cátodo encima de la mitad derecha del cerebro medio antes de la aplicación de una corriente. La abertura en la cáscara del huevo se cierra con cinta y los embriones se incuban durante todo el tiempo necesario para cualquier análisis. Este método fue descrito originalmente por Muramatsu et al. 6 y mejorado por Momose et al. 8 para la transfección área específica. <img src="/files/ftp_upload/50024/50024schematic1.jpg" fo:content-width-="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50024/50024schematic1highres.jpg"/> Resumen Esquemático. <ol><li> El embrión en el huevo es expuesto por el corte de una pequeña ventana en the cáscara de huevo. </li><li> El vector (s) disuelta se inyecta en el cerebro medio usando un capilar micro. </li><li> Dos electrodos - colocados en paralelo o por debajo y por encima del embrión - generan un campo eléctrico pulsante. </li><li> El campo eléctrico crea temporalmente poros en la membrana celular, que facilitan la entrada en la célula por el ADN cargado negativamente (o ARN) atraído hacia el ánodo 11,12. </li></ol>

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name </td>
 <td>Company</td>
 <td></td>
 <td>Model</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosillicate glass capillaries </td>
 <td>Hartenstein</td>
 <td></td>
 <td>Model: 0.9 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcapillary puller</td>
 <td>WPI, Berlin</td>
 <td></td>
 <td>Model: Pul1-E</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Electroporator</td>
 <td>Intracel</td>
 <td></td>
 <td>Model: TSSIC</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope - fluorescence </td>
 <td>LEICA</td>
 <td></td>
 <td>Model: MZFLIII</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td></td>
 <td>Model: Stemi</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Camera and software</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td></td>
 <td>Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

in ovo expression of microrna in ventral chick midbrain

RNAs no codificantes son jugadores adicionales en la regulación de la expresión génica. Dirigida en la electroporación in ovo de áreas específicas proporciona una herramienta única para el control espacial y temporal de la expresión de microARN ectópico. Sin embargo, las estructuras del cerebro como ventrales del cerebro medio ventral son más bien difíciles de alcanzar para cualquier manipulaciones. Este sentido, demuestran una forma eficiente de electroporar miRNA en el mesencéfalo ventral usando electrodos de platino delgada. Este método ofrece una forma fiable para transfectar las áreas específicas del cerebro medio y una herramienta útil para los estudios in vivo.

La extensión de la zona del cerebro medio transfectadas con MIR es visible a través de la expresión de GFP a partir de un vector indicador inyectado junto con el vector de expresión de miR (Figura 2). El uso de electrodos de platino con un diámetro de 0,5 mm y colocado paralelo al eje de AP de cables del cerebro medio normalmente a la transfección de una zona amplia a lo largo de la-y DV AP-eje, incluyendo rombencéfalo, mesencéfalo y diencéfalo veces (Figuras 2A y B). El tamañ...

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In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

La expresión ectópica es una técnica para dilucidar el papel microRNAs en el desarrollo del cerebro. Sin embargo, la focalización en áreas específicas mediante electroporación in ovo es un reto. Aquí, se muestra una forma eficiente a las regiones del cerebro medio ventral y dorsal selectiva electroporar.

En Expression in ovo de microARN en ventral del polluelo Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Culturas organotípicos rebanada de mesencéfalo ventral embrionario: Un sistema para estudiar el desarrollo neuronal dopaminérgica In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Investigación

Neurociencias

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Imágenes de alta resolución en vivo del comportamiento de las células en el desarrollo de neuroepitelio

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

En electroporación in ovo en el mesencéfalo polluelo para estudiar la función génica en el desarrollo neuronal dopaminérgica

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

Perfiles Integral del Reglamento de la dopamina en la sustancia negra y el área tegmental ventral

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dos registros electrofisiológicos de sinápticamente respuestas evocadas neuronal y astroglial en agudas rodajas de hipocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

RNA-Seq Análisis de Expresión diferencial de genes en electroporación de embriones de pollo de la médula espinal

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Modulaciones Ambientales del Número de dopamina mesencéfalo neuronas en ratones adultos

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

La identificación fiable de las neuronas dopaminérgicas de estar en el mesencéfalo culturas utilizando ARN-Secuenciación y promotor impulsado TH expresión de EGFP

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

Un modelo de Ovo para probar compuestos de insulina-mimético

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

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Trazado anatómico y funcional combinado in vivo de terminales de glutamato del área tegmental ventral en el hipocampo

Optogenetic modulation of neuron sub-populations in the brain has allowed researchers to dissect neural circuits in vivo and ex vivo. This provides a ...