Name: in ovo expression of microrna in ventral chick midbrain
Uploaded: 2013-09-16T07:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain at JoVE.com

Vi erkänner K. Mikic, som bidrog till den inledande fasen av den här filmen och M. Nicolescu för miR bilden. C. Huber fick stöd av ett stipendium av IZKF av Universtitätsklinikum Tübingen, A. Alwin Prem Anand av Fortune program Universtitätsklinikum Tübingen.

1. Krav på I ovo elektroporering <ol><li> Förbereda vektorkonstruktet: miR sense och antisense primers utformades efter instruktioner från Ambion, glödgad och ligerades i Apal / EcoRI diger pSilencer U6.1 vektor. Efter lyckad omvandling en av de resulterande klonerna odlades och pSilencer plasmid isolerades genom alkalisk lys metod med en Quiagen midi förberedelse kit. </li><li> Elektroder: Elektroder kan köpas eller lätt byggas 13. Vi använder self-made el...

<ol>
	<li>Kutter, C., Svoboda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA,+siRNA,+piRNA:+Knowns+of+the+unknown.">miRNA, siRNA, piRNA: Knowns of the unknown.</a> RNA Biol. 5, 181-188 (2008).</li><li>Szell, M., Bata-Csorgo, Z., Kemeny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enigmatic+world+of+mRNA-like+ncRNAs:+their+role+in+human+evolution+and+in+human+diseases.">The enigmatic world of mRNA-like ncRNAs: their role in human evolution and in human diseases.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 141-148 (2008).</li><li>Li, X., Jin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+small+regulatory+RNAs+in+determining+neuronal+identity.">Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity.</a> Nature reviews. Neuroscience. 11, 329-338 (2010).</li><li>Riedmann, L. T., Schwentner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA,+siRNA,+piRNA+and+argonautes:+news+in+small+matters.">miRNA, siRNA, piRNA and argonautes: news in small matters.</a> RNA Biol. 7, 133-139 (2010).</li><li>Coolen, M., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+brain+development+and+physiology.">MicroRNAs in brain development and physiology.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19, 461-470 (2009).</li><li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).</li><li>Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shocking'+developments+in+chick+embryology:+electroporation+and+in+ovo+gene+expression.">Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).</li><li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+gene+expression+in+chick+embryos+by+microelectroporation.">Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation.</a> Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).</li><li>Nakamura, H., Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misexpression+of+genes+in+brain+vesicles+by+in+ovo+electroporation.">Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 42, 199-201 (2000).</li><li>Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+temporally+controlled+electroporation+of+early+chick+embryos.">Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos.</a> Nat. Protoc. 3, 419-426 (2008).</li><li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Gene Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> The EMBO journal. 1, 841-845 (1982).</li><li>Potter, H., Weir, L., Leder, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer-dependent+expression+of+human+kappa+immunoglobulin+genes+introduced+into+mouse+pre-B+lymphocytes+by+electroporation.">Enhancer-dependent expression of human kappa immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 7161-7165 (1984).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function.">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Dev. Dyn. 229, 433-439 (2004).</li><li>Canto-Soler, M. V., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+cup+and+lens+development+requires+Pax6+expression+in+the+early+optic+vesicle+during+a+narrow+time+window.">Optic cup and lens development requires Pax6 expression in the early optic vesicle during a narrow time window.</a> Developmental biology. , 294-2119 (2006).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951.">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Dev Dyn. 195, 231-272 (1992).</li><li>Muramatsu, T., Nakamura, A., Park, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation:+a+powerful+and+convenient+means+of+nonviral+gene+transfer+to+tissues+of+living+animals+(Review).">In vivo electroporation: a powerful and convenient means of nonviral gene transfer to tissues of living animals (Review).</a> Int J Mol Med. 1, 55-62 (1998).</li><li>Agoston, Z., Li, N., Haslinger, A., Wizenmann, A., Schulte, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+physical+interaction+of+Meis2,+Pax3+and+Pax7+during+dorsal+midbrain+development.">Genetic and physical interaction of Meis2, Pax3 and Pax7 during dorsal midbrain development.</a> BMC Dev Biol. 12, 10 (2012).</li><li>De Pietri Tonelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+detection+of+microRNAs+in+developing+vertebrate+embryos+after+acute+administration+of+a+dual-fluorescence+reporter/sensor+plasmid.">Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid.</a> Biotechniques. 41, 727-732 (2006).</li></ol>

Denna video visar en effektiv metod för transfektion plasmid i neuroepiteliala cellerna i specifika områden i chick mitthjärnan. Rektangulära elektriska pulser med låg spänning kan introducera DNA in i celler av chick neuralröret in ovo 6,16. Dock är noggrannheten hos DNA-målinriktning ofta försvåras av det stora elektriska fältet, som stiger upp genom de relativt stora elektroder (Φ = 0,5 mm). Vi försökte tackla det problemet genom att använda elektroder mindre diameter följa riktli...

Erkännandet av små icke-kodande RNA som extra spelare för genuttryck lanserat en ny komplexitet till genomisk programmering / genreglering. Olika arter av icke-kodande RNA har funktionell betydelse i neurala celler, inklusive små icke-kodande RNA 1-4. MikroRNA (MIR eller miRNA) t.ex. visar tydliga och skiftande uttryck profiler i utvecklings hjärnor 5. Riktade in ovo elektroporering av kycklingembryon ger en unik möjlighet till tid och rum kontroll av genuttryck och tystar under utveckling. Denna video visar de olika stegen för att utföra ektopisk uttryck av miRs i specifika områden i chick mitthjärnan med hjälp av in ovo elektroporering 6-10. För att säkerställa en långvarig effekt av dessa små icke-kodande RNA-molekyler i celler, DNA-sekvensen av miRs klonas in i mono-eller bi-cistronic vektorer. För in ovo elektroporation, miR innehåller vector insprutas i mitthjärnan neurala röret genom att exponera embryon efter att ha gjort ett litet fönster i äggskalet. För att transfektera specifika områden i mitthjärnan litet plus (anod) och minus (katod) platinaelektroder är placerade vid specifika positioner. För ventrala mitthjärnan transfektion, är anoden placerad under det vänstra ventrala mitthjärnan och katoden ovanför den högra halvan av mitthjärnan innan en ström. Öppningen i äggskal är stängd med tejp och embryon inkuberas under så lång tid som erfordras för varje analys. Metoden beskrevs ursprungligen av al. Muramatsu et 6 och förbättras genom Momose et al. 8 för visst område transfektion. <img src="/files/ftp_upload/50024/50024schematic1.jpg" fo:content-width-="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50024/50024schematic1highres.jpg"/> Schematisk översikt. <ol><li> Embryot i ägget exponeras genom att skära ett litet fönster i the äggskal. </li><li> Den upplösta vektorn (vektorerna) injiceras i mitthjärnan med användning av en mikro kapillär. </li><li> Två elektroder - placerade parallellt eller under och ovanför embryot - genererar en pulserande elektriskt fält. </li><li> Det elektriska fältet skapar tidsmässigt porer i cellmembranet, som underlättar inträde i cellen av det negativt laddade DNA (eller RNA) attraheras till anoden 11,12. </li></ol>

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name </td>
 <td>Company</td>
 <td></td>
 <td>Model</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosillicate glass capillaries </td>
 <td>Hartenstein</td>
 <td></td>
 <td>Model: 0.9 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcapillary puller</td>
 <td>WPI, Berlin</td>
 <td></td>
 <td>Model: Pul1-E</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Electroporator</td>
 <td>Intracel</td>
 <td></td>
 <td>Model: TSSIC</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope - fluorescence </td>
 <td>LEICA</td>
 <td></td>
 <td>Model: MZFLIII</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td></td>
 <td>Model: Stemi</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Camera and software</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td></td>
 <td>Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

in ovo expression of microrna in ventral chick midbrain

Icke-kodande RNA finns ytterligare aktörer reglera genuttrycket. Riktade in ovo elektroporering av specifika områden ger ett unikt verktyg för rumsliga och tidsmässiga kontroll av ektopisk mikroRNA uttryck. Men ventrala hjärnstrukturer som ventrala mitthjärnan är ganska svårt att nå för eventuella manipulationer. Här visar vi ett effektivt sätt att elektroporera miRNA i ventrala mitthjärnan med användning av tunna platinaelektroder. Denna metod erbjuder ett tillförlitligt sätt att transfektera specifika områden i mellanhjärnan och ett användbart verktyg för in vivo-studier.

Omfattningen av mitthjärnan område transfekterad med miR är synlig genom uttryck av GFP från en reportervektor injicerades tillsammans med miR uttryckande vektorn (Figur 2). Användning av platinaelektroder med en diameter av 0,5 mm och placeras parallellt med AP-axeln i mitthjärnan leder normalt till transfektion av ett brett område längs den DV-och AP-axeln, inklusive bakhjärnan, mitthjärnan och ibland diencefalon (Fig. 2A och B). Storleken hos elektroderna resulterar i ett s...

Watch this Scientific Journal Video about In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain at JoVE.com

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ektopisk uttryck är en teknik för att belysa mikroRNA roll i hjärnans utveckling. Men upp specifika områden med hjälp av in ovo elektroporation är utmanande. Här visar vi ett effektivt sätt att selektivt electroporate ventrala och dorsala mitthjärnan regioner.

I ovo Uttryck av MikroRNA i ventrala Chick mitthjärnan

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice kulturer av embryonala på magen mitthjärnan: Ett system att studera Dopaminerga nervsystemets utveckling In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Högupplöst Live avbildning av cellens beteende i utvecklingsländerna neuroepitelet

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

I ovo elektroporering i Chick mitthjärnan för att studera genfunktion av dopaminerg Neuron utveckling

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

Omfattande Profilering av dopamin förordning i substantia nigra och ventrala tegmentumområdet

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dubbla Elektrofysiologiska Inspelningar av synaptiskt-framkallade astrogliala och neuronala svar i akut hippocampus skivor

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

RNA-Seq analys av Differential genuttryck i elektro Chick embryonala Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Miljö modulation av antalet mitthjärnan dopaminneuroner i vuxna möss

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

Tillförlitlig identifiering av Living dopaminerga neuroner i mellanhjärnan kulturer Använda RNA sekvensering och TH-promotor-driven EGFP uttryck

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

En i Ovo -modell för att testa Insulin-liknande föreningar

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus

Kombinerad in Vivo anatomisk och funktionell spårning av ventralt tegmentalområde glutamatterminaler i Hippocampus

Optogenetic modulation of neuron sub-populations in the brain has allowed researchers to dissect neural circuits in vivo and ex vivo. This provides a ...