Name: detection of protein palmitoylation in cultured hippocampal neurons by immunoprecipitation and acyl-biotin exchange (abe)
Uploaded: 2013-02-18T13:00:00
Duration: 16 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами от Канадского института исследований в области здравоохранения MOP-восемьдесят одна тысяча сто пятьдесят-восемь.

<ol>
	<li>Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+palmitoylation+in+neuronal+development+and+synaptic+plasticity.">Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 161-175 (2010).</li><li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+palmitoyl-proteomics+reveals+dynamic+synaptic+palmitoylation.">Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation.</a> Nature. 456, 904-909 (2008).</li><li>Drisdel, R. C., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+and+quantifying+sites+of+protein+palmitoylation.">Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation.</a> Biotechniques. 36, 276-285 (2004).</li><li>Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylated+proteins:+purification+and+identification.">Palmitoylated proteins: purification and identification.</a> Nat. Protoc. 2, 1573-1584 (2007).</li><li>Xie, C., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+hippocampal+and+cortical+neurons+in+a+mixture+of+MEM++and+B27-supplemented+neurobasal+medium.">Survival of hippocampal and cortical neurons in a mixture of MEM+ and B27-supplemented neurobasal medium.</a> Free Radic. Biol. Med. 28, 665-672 (2000).</li><li>Drisdel, R. C., Alexander, J. K., Sayeed, A., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+of+protein+palmitoylation.">Assays of protein palmitoylation.</a> Methods. 40, 127-134 (2006).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. W. e. s. t. e. r. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blotting:+Sample+Preparation+to+Detection.">Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).</li><li>Huang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+palmitoyl+acyl+transferases+exhibit+distinct+substrate+specificity.">Neuronal palmitoyl acyl transferases exhibit distinct substrate specificity.</a> FASEB J. 23, 2605-2615 (2009).</li><li>Noritake, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobile+DHHC+palmitoylating+enzyme+mediates+activity-sensitive+synaptic+targeting+of+PSD-95.">Mobile DHHC palmitoylating enzyme mediates activity-sensitive synaptic targeting of PSD-95.</a> J. Cell Biol. 186, 147-160 (2009).</li><li>Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation+by+DHHC5/8+Targets+GRIP1+to+Dendritic+Endosomes+to+Regulate+AMPA-R+Trafficking.">Palmitoylation by DHHC5/8 Targets GRIP1 to Dendritic Endosomes to Regulate AMPA-R Trafficking.</a> Neuron. 73, 482-496 (2012).</li><li>Hayashi, T., Thomas, G. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+palmitoylation+of+NR2+subunits+regulates+NMDA+receptor+trafficking.">Dual palmitoylation of NR2 subunits regulates NMDA receptor trafficking.</a> Neuron. 64, 213-226 (2009).</li><li>Ho, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-Nitrosylation+and+S-Palmitoylation+Reciprocally+Regulate+Synaptic+Targeting+of+PSD-95.">S-Nitrosylation and S-Palmitoylation Reciprocally Regulate Synaptic Targeting of PSD-95.</a> Neuron. 71, 131-141 (2011).</li><li>Iwanaga, T., Tsutsumi, R., Noritake, J., Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+protein+palmitoylation+in+cellular+signaling.">Dynamic protein palmitoylation in cellular signaling.</a> Prog. Lipid Res. 48, 117-127 (2009).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

IP-ABE анализа, представленные здесь, простой и очень чувствительный метод для обнаружения palmitoylated белков в культивируемых первичных нейронов гиппокампа, который обычно используется для стандартных биохимических методов. Это делает анализ легко адаптируется для лабораторий уже оснащены западных промокательной материалов. IP-ABE анализа сочетает в себе стандартный протокол иммунопреципитации, чтобы изолировать и обездвижить своего белка-мишени, а затем описанной ранее ABE химии 2-4 для быстрого выявления уровня пальмитата на подложке белка. Техника ABE имеет широкий спектр применения для изучения palmitoylated белков в различных тканях и клеточных линий, в том числе крупномасштабных пальмитоил-протеомных скрининг глобальных профилей palmitoylation, и быстрое обнаружение palmitoylation уровня одного белка-мишени. Предыдущее описание ABE химии использовали различные методы лизис клетки и моющие средства извлечения нейронов прот2 Eins, 9, свободный тиол-блокады 10, 11, биотинилирование и очистки целевого белка 4, в зависимости от применения эксперимента. Кроме того пальмитата в нейронных результаты белки в их таргетинг на клеточные мембраны, и обнаружение palmitoylated доля белка-мишени будет требовать его извлечения из этих мембран. Ранее описанный ABE методологии использовались различные ионные 9 и неионные детергенты 8 до извлечения желаемого белков-мишеней, а также использование конкретного моющего средства зависит от белка-мишени и ее известные мембраны с торговлей людьми. Здесь мы используем неденатурирующем и неионогенных моющих средств IGEPAL CA-630 для извлечения palmitoylated белки, которые мы утверждена для добычи и обнаружения palmitoylated нейронов белки δ-катенина (рис. 2). Структура IGEPAL CA-630 включает в себя громоздкой и жесткой неполярных головной группы, которые ненарушать нативную конформацию белка или взаимодействий, но позволяет его связь с гидрофобными участками мембранных белков, связанных, тем самым присвоении смешиваемость с ними и позволяет их добычи. Многие нейронов белки локализованы в постсинаптической мембраны или пост-синаптические плотность синапсов должны быть извлечены при помощи IGEPAL CA-630, однако некоторые из них не может полностью растворить, и может потребовать использования различных неденатурирующем моющих средств, как Тритон Х-100, который имеет ранее использована для ABE химия 2, 8. Несколько описаний ABE химии также используются различные тиол-реактивного биотинилирование реагента от молекулы мы описываем здесь, называется биотин-HPDP (Thermo Scientific), которая также требует различных способов очистки белков 4. Биотин-HPDP другой тиол-реактивный, maliemide конъюгированных биотин молекула, которая содержит дисульфидные связи в maliemide руку компоновщик, структурно-Differentiating его из биотин-BMCC, которые не содержат этот дисульфидных связей. После тиол-биотинилирования бесплатно или palmitoylated цистеина белка по биотин-HPDP, в результате дисульфидные связи между белком-мишенью и группа биотина может быть расщеплены за счет сокращения реагентов, чтобы освободить биотин группы и регенерации белков в его исходной форме, что делает биотинилирование Биотин по-HPDP переходных и обратимы. Таким образом, использование этого реагента биотинилирование требует очистки целевого белка авидина иммобилизованных реагентов, таких как покрытых стрептавидином шарики. Тем не менее, тиол-биотинилирования целевого белка биотин-BMCC, как мы описываем здесь, является стабильной и относительно постоянной, и требует очистки целевого белка антитела, направленные против цели, и иммобилизованными на сефарозе бисера. Оба ABE методы были ранее использованы для крупномасштабного экраны, и обнаружение palmitoylation одного белков 2, 8-10, 12 иIP-ABE анализа мы опишем здесь является оптимальной для быстрого обнаружения palmitoylation одного нейрона белки-мишени. Подавляющее большинство сотовых palmitoylation связано с обратимой добавлением пальмитата в тиоловой группой цистеина (называется S-palmitoylation, которые мы обобщаем как «palmitoylation» в этом протоколе), однако очень ограниченная группа белков подвергается необратимым palmitoylation на глицин и остатков цистеина посредством формирования стабильной амидных связей, называемых N-palmitoylation 13. Одним из ограничений ABE химии является ее неспособность обнаружить N-palmitoylation благодаря стабильности амидной связи, и поэтому показ новой белка-мишени для palmitoylation должно быть подтверждено с помощью 3Н-пальмитат метаболических маркировке 1. Как упоминалось ранее, IP-ABE анализ может быть легко адаптирована для изучения palmitoylation в белковых экстрактов из различных источников, в том числе переходsfected гетерологичных клеточных линий, основной ткани и первичных нейронов культур из различных областей мозга. IP-ABE анализа была использована для изучения palmitoylation достаточности мутировал цистеин-на-серин белков для определения местоположения palmitoylated цистеина по белку-мишени 8, для изучения динамической оборот пальмитата в синаптических белков в культивируемых нейронов в базальных условиях 10, и изменения в palmitoylation уровне нейронов белки после индукции нейронной активности 9. Чувствительность и адаптируемость IP-ABE анализа делают его идеально подходящим для изучения palmitoylation профилей нейронов белки, оптимальные для выявления динамических изменений в palmitoylation.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> IGEPAL CA-630 </td><td> Сигма </td><td> I8896 </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Fluka </td><td> 93482 </td><td></td></tr><tr><td> Коктейль ингибитор протеазы </td><td> Roche Полное мини </td><td> 11 836 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> NEM </td><td> Сигма </td><td> E3876 </td><td></td></tr><tr><td> HAM решения </td><td> Сигма </td><td> 46780-4 </td><td></td></tr><tr><td> BCA Protein Assay Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23225 </td><td> Обеспечение совместимости с выбранным моющим средством </td></tr><tr><td> Белки G / покрытием бисера сефарозе </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-6002-35 </td><td></td></tr><tr><td> Биотин-BMCC </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21900 </td><td></td></tr><tr><td> Стрептавидин-HRP </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21126 </td><td> Развести в 1 мг / мл в воде </td></tr><tr><td> Вестерн-блот зачистки буфера </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21059 </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of protein palmitoylation in cultured hippocampal neurons by immunoprecipitation and acyl-biotin exchange (abe)

Palmitoylation это пост-трансляционной модификации липидов с участием крепление 16-углеродной насыщенные жирные кислоты, пальмитат, чтобы остатков цистеина субстрата белков через лабильный тиоэфир связь [отзывы в 1]. Palmitoylation подложки белка повышает его гидрофобность, и, как правило облегчает торговлю на клеточные мембраны. Недавние исследования показали, palmitoylation одним из наиболее распространенных липидных модификаций в 1 нейронами, 2, предполагая, что пальмитат оборота является важным механизмом, с помощью которого эти клетки регулируют адресности и торговли белков. Идентификации и обнаружения palmitoylated субстратов может поэтому лучше нашего понимания белка торговли в нейронах. Обнаружение белка palmitoylation в прошлом был технически затруднено из-за отсутствия консенсуса между подложкой последовательности белков, а также опора на метаболические labeliнг пальмитоил-белки с 3 H-пальмитат, времени биохимического анализа с низкой чувствительностью. Развитие ацил-биотин бирже (ABE) анализ позволяет более быструю и высокую чувствительность обнаружения palmitoylated белки 2-4, и является оптимальным для измерения динамических оборот пальмитата на нейрональных белков. Анализ ABE состоит из трех биохимических этапов (рис. 1): 1) необратимой блокады немодифицированных группы тиоловых цистеина использованием N-ethylmaliemide (NEM), 2) специфическое расщепление и разоблачение тиоловых групп palmitoylated цистеина путем гидроксиламина (HAM), и 3) селективная маркировки palmitoylated цистеина помощью тиоловых-реактивного биотинилирование реагента, биотин-BMCC. Очистка тиол-биотинилированных белков после ABE шаги были различны, в зависимости от общей цели эксперимента. Здесь мы опишем метод, чтобы очистить palmitoylated белка в первичном гиппокампадр. нейронов начальной иммунопреципитации (IP) шаг, используя антитела, направленные против белков, а затем с помощью анализа ABE и западных промокательной непосредственно измерить palmitoylation уровня этого белка, который называется IP-ABE анализа. Низкая плотность культур эмбриональных нейронов гиппокампа крысы были широко используется для изучения локализации, функции и торговли нейронов белки, что делает их идеально подходит для изучения нейронных palmitoylation белка использованием IP-ABE анализа. IP-ABE анализа основном требуется стандартный IP и западных промокательной реагентов и ограничивается только наличием антител против целевой подложки. Этот анализ может быть легко адаптирована для очистки и обнаружения трансфицированных palmitoylated белков в клеточных культурах гетерологичного, первичных нейронов культур, полученных из различных тканей мозга мыши и крысы, и даже первичная ткань мозга сама.

IP-ABE анализа конкретно определяет тиол-palmitoylation остатков цистеина вдоль подложки белков, и могут быть использованы для обнаружения palmitoylation из иммунопреципитации нейронов белки таким образом, изображенной на рисунке 1. Лечение иммунопреципитации нейронов белки с ветчиной (рис. 1) расщепляет тиоэфир связь между пальмитат и тиоловой группы цистеина, что позволяет для конкретного включения биотин-BMCC на вновь доступны тиоловых групп, которые могут быть впоследствии обнаружены с помощью вестерн-блоттинга. Бездействие HAM (минус-HAM) расщепления предотвращает включение биотин-BMCC и функций в качестве отрицательного контроля для конкретных пальмитоил-биотинилирования плюс-HAM образца, и поэтому должны всегда работать рядом с плюс-HAM образцом для западных блоттинга на SDS-PAGE (рис. 2). В оптимизированных эксперимента (рис. 2а), palmitoylationСигнал нейронов белки δ-катенина 2 может быть легко обнаружен блоттинга для биотин-BMCC в концентрации 1 мкМ, с помощью стрептавидин сопряженных с HRP, против параллельной минус-и плюс-HAM образцов. Определенный сигнал palmitoylation для δ-катенина появляется на его предсказать размер 160kD, только в плюс-HAM образца. Специфика этот сигнал был подтвержден reprobing для δ-катенина с конкретными антитела, которые изначально предназначался для иммунопреципитации его, в результате чего сигнал в обоих HAM лечения, в то же предсказал размер. Оптимизация IP-ABE анализа (рис. 2A) приведет к западной промокательной профиль минус-HAM образца, который легко отличить от плюс-HAM образца, и обладает минимальным, чтобы не palmitoylation сигнала. Концентрация биотина BMCC используется для обозначения palmitoylated цистеина требует тщательной оптимизации, и если супер-насыщающей концентрации биОтин-BMCC используется в химии ABE шагов (рис. 2В), чрезмерные фон и неспецифические сигналы будут видны. Линейную кривую ответа на биотинилирования palmitoylated нейронов белки, α7 никотинового рецептора ацетилхолина, используя биотин-BMCC ранее были определены 6, и показывает почти полное насыщение при концентрации 5-10 мкМ. Хотя оптимальная концентрация биотина BMCC будет несколько отличаться в зависимости от нейронов белка-мишени, лечение с биотин-BMCC в концентрации более 5 мкм, скорее всего, супер-насыщения белка-мишени, и в результате западной профиль пятно с видимым фоном и неспецифические сигналы. Концентрации 0,5 мкМ для биотин-BMCC был ранее использован для обнаружения palmitoylation других нейронов белки, включая SNAP-25, гентингтина, АМРА подразделений GluA1 и GluA2, и paralemmin 8, и определение оптимальной концентрации для романабелка-мишени может быть достигнуто путем проб и ошибок в линейном порядке, начиная в диапазоне 0.5-5 мкм, что мы описываем здесь. В результате стрептавидин вестерн-блот профилей среди минус-и плюс-HAM образцов для δ-катенина palmitoylation кажутся похожими, когда обрабатывали 4 мкМ биотин-BMCC (рис. 2В), с дополнительными сигналами фона в различных размерах, что свидетельствует о нарушении биотинилирование произошло. Гидроксиламин является мощным восстановителем, что приводит к ограниченной деградации белка-мишени, в дополнение к его эффективному расщеплению тиоэфир связи. Следовательно, оптимизация ABE химии требует от одного до нормализации количества иммунопреципитации белков используются для минус-и плюс-HAM образцов (шаг 3,2 - 3,3). Нормализация требует использования двойного количества иммобилизованного белка-мишени в плюс по сравнению с минус-HAM образца, который фактически приводит к неотличимы западныйп-блоттинга профили для белка-мишени, как показано на δ-катенина (рис. 2A, B). Однако, если количество иммобилизованного белка-мишени не нормируется между минус-и плюс-HAM образцов, полученный западной сигнал пятном для целевого белка в плюс-HAM образцы могут быть потеряны, как показано на δ-катенина при равных количествах белки были использованы в обоих HAM лечения (рис. 2). Специфика ABE химии для маркировки palmitoylated белки очень чувствительна и требует оптимизации. Распространенных ошибок, возникших в ходе IP-ABE анализа включают суб-оптимальные результаты показаны на рис 2Б и 2В, и деградации белка-мишени, независимо от HAM лечение, которое, как правило, вызваны старше реагентов и буферов, и неправильный рН. Для того, чтобы избежать этих ошибок и исправлять неоптимальной химии ABE, свежести и концентрации реагентов, необходимых длябуферы приведены в таблице 1 всегда должно быть рассмотрено, и рН настройки все буферы всегда должны быть проверены перед запуском эксперимента. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Буфер </td><td> Рабочая концентрация </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> Буфера для лизиса (LB) </td><td> В дистиллированной H 2 O: 1% IGEPAL CA-630 50 мМ Трис-HCl, рН 7,5 150 мМ NaCl, 10% глицерина </td><td> N / A </td><td> Подготовка перед экспериментом и хранить при 4 ° C </td></tr><tr><td> Решение NEM </td><td> В 100% EtOH: NEM лиофилизированный порошок </td><td> 2 M </td><td> Подготовить свежие, непосредственно перед применением. </td></tr><tr><td> Строгие буфера </td><td> В LB: 10 мМ MEM 0,1% SDS </td><td> N / A </td><td> Подготовка непосредственно перед использованием, держать на льду. </td></tr><tr><td> LB рН 7,2 </td><td> В LB: Отрегулируйте рН до 7,2 раз </td><td> N / A </td><td> Использование рН-метра для регулирования рН непосредственно перед употреблением. </td></tr><tr><td> HAM буфера </td><td> В LB рН 7,2: Фото со HAM решения </td><td> 1 M (конечная концентрация HAM) </td><td> Подготовка непосредственно перед употреблением. </td></tr><tr><td> LB рН 6,2 </td><td> В LB: Отрегулируйте рН до 6,2 раз </td><td> N / A </td><td> То же, что и для LB рН 7,2 </td></tr><tr><td> Со биотин-BMCC решение </td><td> В ДМСО: 2,1 мг Биотин-BMCC решения </td><td> 8 мМ </td><td> Подготовка непосредственно перед употреблением. </td></tr><tr><td> Биотин-BMCC буфера </td><td> В LB рН 6,2: Добавить биотин-BMCC решения </td><td> 1 - 5 мкМ (конечная биотин-BMCC концентрации) </td><td> Подготовка непосредственно перед употреблением. </td></tr><tr><td> 2х SDS буфера для образца, не восстановителей </td><td> В дистиллированной H 2 O: 5% SDS 5% глицерина 125 Трис-HCl, рН 6,8 0,01% Bromophenol синий </td><td> N / A </td><td> Подготовка перед экспериментом, и хранить при температуре -20 ° С до использования. Дополнение 5 мМ DTT перед использованием. </td></tr></tbody></table> Таблица 1. Буферы и реагенты, необходимые для IP-ABE анализа. Многие из лизис буфера могут быть подготовлены до начала эксперимента, однако рН должна быть проверена и скорректирована непосредственно перед использованием с помощью рН-метра, чтобы обеспечить успех химии ABE. Большинство фондовых решения должны быть подготовлены свежей для каждого эксперимента, непосредственно перед применением. Многие из буфера требует реагентов, общих для большинства лабораторий, оснащенных для биохимии и специальных реагентов с поставщиком информации, перечисленные в таблице реактивов и оборудования. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-страница = &quot;Всегда&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50031/50031fig1.jpg" alt="Рисунок 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50031/50031fig1highres.jpg" /> Рисунок 1. Схема Иммунопреципитация и ацил-биотин бирже (IP-ABE) анализа для очистки и обнаружения palmitoylation нейронов белки. Искусственный нейронов гиппокампа лизируются, (1) белка-мишени, затем очищают, используя мишень-специфических антител, иммобилизованных на сефарозе гранул, покрытых белком G и А. очищенной целевой белок является то (2) обрабатывают N-ethylmaliemide (NEM) необратимо связывается и блокирует свободный тиол (-SH) группы по немодифицированных цистеина (С). Белка-мишени, затем (3) подвергались лечению с гидроксиламин (HAM), в результате специфического расщепления тиоэфир облигаций на palmitoylated цистеина и разоблачение бесплатно palmitoylated тиоловой группы (-SH). Далее, белка-мишени (4) treateD с тиол-реактивных молекул биотин, биотин-BMCC, в результате конкретной биотинилирования palmitoylated цистеина. И, наконец, (5) биотинилированного белка-мишени вымывают и удаляют из антитела и шарик. Белка-мишени с palmitoylated цистеина (ы) с тегом биотин сейчас подходят для SDS поли-акриламида гель-электрофореза (SDS-PAGE) и вестерн-блоттинга с стрептавидином для обнаружения palmitoylation очищенной нейронов белки. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50031/50031fig1large.jpg" target="_blank">Нажмите, чтобы увеличить рисунок</a> . <img src="/files/ftp_upload/50031/50031fig2.jpg" alt="Рисунок 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50031/50031fig2highres.jpg"/> Рисунок 2. Обнаружение palmitoylation нейронных белка δ-катенина использованием IP-ABE анализа. Первичная гиппокампа крыс нейроны были выращены в качестве предварительногоviously описал 5, при плотности 130 клеток / мм 2 до погашения в 14DIV, затем лизируются, и подвергаются IP-ABE анализа для выявления palmitoylation из недавно идентифицированных нейронов palmitoylated подложки, δ-катенина 2. Очищенный иммунопреципитатах (КП) из δ-катенина (белка-мишени) были выделены с использованием 5 мкг δ-катенин антитела в образце (лабораторий BD Transduction), а затем подвергали SDS-PAGE в параллельном минус-и плюс-гидроксиламина (HAM) образцам. Palmitoylation был обнаружен вестерн-блоттинга (ВБ) со стрептавидин-HRP (palmitoylation), и мембрана была раздета и подвергают reprobe ВБ для δ-катенина. (A) оптимизированный представителя IP-ABE результат для palmitoylated δ-катенина (стрелки) обрабатывают 1 мкМ биотин-BMCC, иллюстрирующие специфику ABE химии для обнаружения тиол-palmitoylated белков из IP образцов. (B) неоптимальной предтель IP-ABE результат для δ-катенина, где избыточной концентрации 4 мкМ биотин-BMCC был использован, в результате неспецифических сигналов и фона в обоих минус-и плюс-HAM образцов (стрелки). (C) Еще один неоптимальной представителя IP-ABE ВБ для δ-катенина, где чрезмерная 4 мкМ концентрация биотина BMCC был использован, и количество белка, используемого для плюс-HAM IP выборка не была нормирована для HAM-опосредованной деградации белков, в результате чего потери сигнала в reprobe ВБ для δ-катенина. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50031/50031fig2large.jpg" target="_blank">Нажмите, чтобы увеличить показатель</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE at JoVE.com

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Обратимые добавлением пальмитат с белками является важным регулятором внутриклеточных белков торговли. Это представляет особый интерес в нейронах, где много синаптические белки palmitoylated. Мы используем простой биохимический метод для обнаружения palmitoylated белков в культивируемых нейронах, которые могут быть адаптированы для различных типов клеток и тканей.

Обнаружение белка Palmitoylation в культуре нейронов гиппокампа на Иммунопреципитация и ацил-биотин бирже (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection и первичной культуры эмбриональных Мышь гиппокампа и корковых нейронов

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Флуоресценция Восстановление после фотообесцвечивания (FRAP) флуоресценции меткой Белки в Дендритные Шипы культивированный нейронов гиппокампа

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Нейромодуляция и митохондриальной Транспорт: Live изображений в нейронах гиппокампа в течение длительного времени

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Анализ морфологии Дендритные позвоночника в культуре нейронов ЦНС

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Вовлечение рост дендритов в культуре симпатических нейронов

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Выделение и культуре нейронов гиппокампа мышей от пренатального

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Пробирного повреждений ДНК в нейронах гиппокампа с помощью комет

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Фосфат кальция Трансфекцию первичной нейронов гиппокампа

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Флуоресценции и Биолюминесценция изображений субклеточных Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; У пожилых нейронов гиппокампа

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Stripe Assay по изучению притягательные или отталкивающие активность белка подложки с использованием диссоциированных нейронах гиппокампа

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...