Name: whole mount rna fluorescent in situ hybridization of drosophila embryos
Uploaded: 2013-01-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos at JoVE.com

Arbeiten durchgeführt im Lécuyer Labor wird durch Mittel aus dem Nationalen Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), dem kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) und dem Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) unterstützt. Fabio Alexis Lefebvre und Gaël Moquin-Beaudry von NSERC Undergraduate Research studentships unterstützt, während Carole Iampietro vom Angelo Pizzagalli Postdoc-Stipendium unterstützt wird.

Ein. RNA Probe Vorbereitung Übersicht: Der folgende Abschnitt beschreibt die erforderlichen Schritte zum Digoxigenin (DIG)-markierten RNA-Sonden für FISH machen. Der erste Schritt beinhaltet das Klonen oder PCR Amplifikation einer Sequenz entsprechend der transkribierten Region eines Gens von Interesse, die verwendet werden, um eine Sequenz-spezifische Sonde erzeugt wird. Dies kann durch Klonieren der erste Genabschnitt in ein Plasmid, in dem die multiple Klonierungsstelle v...

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	<li>Wilcox, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+principles+of+in+situ+hybridization.">Fundamental principles of in situ hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 41, 1725-1733 (1993).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98, 81-85 (1989).</li><li>Lecuyer, E., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+gene+expression+universe.">Mapping the gene expression universe.</a> Curr Opin Genet Dev. 18, 506-512 (2008).</li><li>Tomancak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+patterns+of+gene+expression+during+Drosophila+embryogenesis.">Global analysis of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis.</a> Genome Biol. 8, 2007-208 (2007).</li><li>Thisse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+expression+of+the+zebrafish+genome+by+large-scale+in+situ+hybridization+screening.">Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening.</a> Methods Cell Biol. 77, 505-519 (2004).</li><li>Quiring, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization.">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. 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F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+embryo+dechorionation.">Drosophila embryo dechorionation.</a> CSH Protoc. , (2007).</li><li>Stapleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+gene+collection:+identification+of+putative+full-length+cDNAs+for+70%+of+D.+melanogaster+genes.">The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes.</a> Genome Res. 12, 1294-1300 (2002).</li><li>Rubin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+complementary+DNA+resource.">A Drosophila complementary DNA resource.</a> Science. 287, 2222-2224 (2000).</li><li>Tomancak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+determination+of+patterns+of+gene+expression+during+Drosophila+embryogenesis.">Systematic determination of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis.</a> Genome Biol. 3, (2002).</li><li>Terashima, J., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+available+food+into+the+number+of+eggs+laid+by+Drosophila+melanogaster.">Translating available food into the number of eggs laid by Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 167, 1711-1719 (2004).</li><li>Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. 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Biol. 714, 31-47 (2011).</li><li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846 (2004).</li></ol>

Für Sonde Syntheseschritte, wir erzeugen typischerweise Run-off-Antisense-RNA-Sonden durch in vitro Transkription von full-length Drosophila cDNAs von Plasmiden in der Drosophila Gene Collection (DGC), eine Ressource auf der folgenden Website detailliert gefunden amplifiziert: <a href="http://www.fruitfly.org/DGC/index.html" target="_blank">http://www .fruitfly.org / DGC / index.html</a> 14,15. Dieser Ansatz wurde ausgiebig in großem Maßstab ISH Studium an Mapping-Genexpression u...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> T7, T3 oder SP6-RNA-Polymerase </td><td> Fermentas Life Sciences </td><td> EP0101, EP0111, EP0131 </td><td> Die Kits enthalten Reaktionspuffer. </td></tr><tr><td> DIG RNA Labeling Mix </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11 277 073 910 </td><td></td></tr><tr><td> RNAguard </td><td> Amersham Biosciences </td><td> 27-0816-01 </td><td></td></tr><tr><td> 3M Natriumacetat </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kalter 100% Ethanol. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kaltem 70% Ethanol. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chlorbleichlauge 1:1 mit Wasser verdünnt. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Heptan </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Methanol </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada </td><td> Katalog Nr. P2308 </td><td></td></tr><tr><td> 40% Formaldehyd-Lösung, frisch zubereitet </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS-Tween-Lösung (PBT) </td><td></td><td> 1xPBS, 0,1% Tween-20 </td><td></td></tr><tr><td> Glycinlösung </td><td></td><td> 2 mg / ml Glycin in PBT </td><td></td></tr><tr><td> HRP-konjugierten Maus-monoklonalen anti-DIG </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc </td><td> 200-032 - 156 </td><td> (1/400 Verdünnung einer 1 mg / ml Stammlösung in PBTB </td></tr><tr><td> HRP-konjugiertem Schaf-monoklonalen anti-DIG </td><td> Roche Applied Science, Laval, QC </td><td> 1 207 733 </td><td> 1/500 Verdünnung der Stocklösung in PBTB </td></tr><tr><td> Biotin-konjugierten Maus-monoklonalen anti-DIG </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA </td><td> 200-062-156 </td><td> (1/400 Verdünnung einer 1 mg / ml Stammlösung in PBTB </td></tr><tr><td> Streptavidin-HRP-Konjugat </td><td> Molecular Probes, Eugene OR, USA </td><td> S991 </td><td> (1/100 Verdünnung einer 1 ug / ml Brühe </td></tr></tbody></table>

whole mount rna fluorescent in situ hybridization of drosophila embryos

Beurteilung der Expression eines Gens, sowie der subzellulären Lokalisation Eigenschaften seiner transkribierte RNA, sind wesentliche Merkmale für das Verständnis seine biologische Funktion während der Entwicklung. RNA in situ Hybridisierung (RNA-ISH) ist eine leistungsfähige Methode zur Visualisierung von RNA Verteilung Eigenschaften verwendet, sei es bei den Organismen, Zellen oder subzellulären Ebene 1. RNA-ISH basiert auf der Hybridisierung einer markierten Nukleinsäure-Sonde (z. B. Antisense-RNA, Oligonukleotiden) komplementär zu der Sequenz eines mRNA oder eines nicht-kodierende RNA Ziel von Interesse 2 basiert. Da das Verfahren erfordert Primärsequenz Information allein zur sequenzspezifischen Sonden zu erzeugen, kann es allgemein zu einem breiten Spektrum von Organismen und Gewebeproben 3 angewendet werden. In der Tat, eine Reihe von großen ISH Studien durchgeführt wurden, um die Genexpression zu dokumentieren und RNA Lokalisation Dynamik in verschiedenen Modellorganismen hat sich auf das führteAufbau wichtiger Community-Ressourcen 4-11. Während eine Vielzahl von Sonden-Markierung und zum Nachweis Strategien im Laufe der Jahre entwickelt worden sind, bieten die kombinierte Verwendung von fluoreszenzmarkierten Nachweisreagenzien und enzymatische Signalverstärkung Schritte signifikante Verbesserungen der Empfindlichkeit und Auflösung des Verfahrens 12. Hier beschreiben wir eine optimierte Fluoreszenz in situ Hybridisierung Verfahren (FISH) unter Verwendung Tyramid Signalverstärkung (TSA), die RNA Expression und Lokalisation Dynamik inszeniert Drosophila-Embryonen zu visualisieren. Das Verfahren wird in 96-well PCR-Platte-Format, das erleichtert die gleichzeitige Verarbeitung einer großen Zahl von Proben durchgeführt.

Wenn erfolgreich durchgeführt, bietet dieses Verfahren eine auffallend erhöhtes Maß an Detail in der räumlich-zeitlichen Analyse von Genexpression und mRNA Lokalisation Dynamik in der frühen Drosophila Embryogenese. In der Tat, wie in 3A für die klassische Pair-rule-Gens runt (run) dargestellt, kann man dieses Protokoll, um die Genexpression Veranstaltungen über den Nachweis des entstehenden transcript Herde in Gruppen zum Ausdruck Kerne beobachten. Zusätzlich, wie im Embryo Mo...

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Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Hier beschreiben wir eine ganze-mount fluoreszierende<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung (FISH)-Protokoll für die Bestimmung der Expression und Lokalisation Eigenschaften von RNAs während der Embryogenese in der Fruchtfliege ausgedrückt,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Research

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Biology

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

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The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

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Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

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Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

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Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

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Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

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Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

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Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

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RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung in whole mount Embryonen und Histologie für Marine Elasmobranchs Angepasst

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

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Hohe Auflösung Ganze Berge<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung innerhalb Zebrafischembryonen Gene Expression und Funktion zu untersuchen

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

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Die Analyse der Apoptose in Zebrafischembryonen von Whole-mount Immunfluoreszenz an aktivierte Caspase 3 Detect

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...