Name: whole mount rna fluorescent in situ hybridization of drosophila embryos
Uploaded: 2013-01-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos at JoVE.com

העבודה שנערכה במעבדת Lécuyer נתמכת על ידי מימון מהלאומיים למדעים והנדסת המועצה של קנדה (NSERC), מכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR) וFonds דה המשוכללת והנדירה en סנטה קוויבק (FRSQ). פאביו אלקסיס לפבר וגאל Moquin-ודרי נתמכת על ידי מחקר לתואר הראשון studentships NSERC, בעוד קרול Iampietro נתמך על ידי מלגת דוקטורט אנג&#39;לו Pizzagalli.

1. הכנת RNA Probe סקירה: הסעיף הבא מתאר את הצעדים הנדרשים כדי להפוך את בדיקות Digoxigenin (Dig) שכותרתו-RNA מתאימות לדגים. השלב הראשון כרוך בשיבוט או מחזק את רצף מקביל לאזור תמלל של גן של עניין שניתן להשתמש כדי ליצור חללית רצף ספציפית PCR. ...

<ol>
	<li>Wilcox, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+principles+of+in+situ+hybridization.">Fundamental principles of in situ hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 41, 1725-1733 (1993).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98, 81-85 (1989).</li><li>Lecuyer, E., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+gene+expression+universe.">Mapping the gene expression universe.</a> Curr Opin Genet Dev. 18, 506-512 (2008).</li><li>Tomancak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+patterns+of+gene+expression+during+Drosophila+embryogenesis.">Global analysis of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis.</a> Genome Biol. 8, 2007-208 (2007).</li><li>Thisse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+expression+of+the+zebrafish+genome+by+large-scale+in+situ+hybridization+screening.">Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening.</a> Methods Cell Biol. 77, 505-519 (2004).</li><li>Quiring, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization.">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).</li><li>Pollet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+differential+gene+expression+during+early+Xenopus+embryogenesis.">An atlas of differential gene expression during early Xenopus embryogenesis.</a> Mech. Dev. 122, 365-439 (2005).</li><li>Lein, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain.">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445, 168-176 (2007).</li><li>Lecuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li><li>Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+blueprint+for+a+chordate+embryo.">Regulatory blueprint for a chordate embryo.</a> Science. 312, 1183-1187 (2006).</li><li>Bell, G. W., Yatskievych, T. A., Antin, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEISHA,+a+whole-mount+in+situ+hybridization+gene+expression+screen+in+chicken+embryos.">GEISHA, a whole-mount in situ hybridization gene expression screen in chicken embryos.</a> Dev. Dyn. 229, 677-687 (2004).</li><li>Wilkie, G. S., Shermoen, A. W., O'Farrell, P. H., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcribed+genes+are+localized+according+to+chromosomal+position+within+polarized+Drosophila+embryonic+nuclei.">Transcribed genes are localized according to chromosomal position within polarized Drosophila embryonic nuclei.</a> Curr. Biol. 9, 1263-1266 (1999).</li><li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+embryo+dechorionation.">Drosophila embryo dechorionation.</a> CSH Protoc. , (2007).</li><li>Stapleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+gene+collection:+identification+of+putative+full-length+cDNAs+for+70%+of+D.+melanogaster+genes.">The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes.</a> Genome Res. 12, 1294-1300 (2002).</li><li>Rubin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+complementary+DNA+resource.">A Drosophila complementary DNA resource.</a> Science. 287, 2222-2224 (2000).</li><li>Tomancak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+determination+of+patterns+of+gene+expression+during+Drosophila+embryogenesis.">Systematic determination of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis.</a> Genome Biol. 3, (2002).</li><li>Terashima, J., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+available+food+into+the+number+of+eggs+laid+by+Drosophila+melanogaster.">Translating available food into the number of eggs laid by Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 167, 1711-1719 (2004).</li><li>Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+protocols+in+Drosophila+embryos+and+tissues.">Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues.</a> Methods Mol. Biol. 420, 289-302 (2008).</li><li>Lecuyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+fluorescent+in+situ+hybridization+in+Drosophila.">High resolution fluorescent in situ hybridization in Drosophila.</a> Methods Mol. Biol. 714, 31-47 (2011).</li><li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846 (2004).</li></ol>

לצעדי סינתזת בדיקה, אנחנו בדרך כלל לייצר חלליות ניגרו antisense RNA שעתוק במבחנה על ידי מcDNAs תסיסנית באורך מלא מוגבר מפלסמידים נמצאו בדרוזופילה ג&#39;ין האוסף (DGC), משאב המפורט באתר הבא: <a href="http://www.fruitfly.org/DGC/index.html" target="_blank">http://www .fruitfly.org / DGC / index.html</a> 14,15. גיש?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> T7, RNA פולימראז T3 או SP6 </td><td> Fermentas מדעי חיים </td><td> EP0101, EP0111, EP0131 </td><td> ערכות מכילות מאגר התגובה. </td></tr><tr><td> DIG-RNA תיוג מיקס </td><td> רוש יישומי מדע </td><td> 11 277 073 910 </td><td></td></tr><tr><td> RNAguard </td><td> Amersham Biosciences </td><td> 27-0816-01 </td><td></td></tr><tr><td> יצטט נתרן 3M </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 100% אתנול קר. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 70% אתנול קר. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> פתרון אקונומיקה מדוללת במים 01:01. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Heptane </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> מתנול </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> proteinase K </td><td> סיגמה אולדריץ Oakville, ON, קנדה </td><td> המספר P2308 </td><td></td></tr><tr><td> 40% תמיסת פורמלדהיד, מוכן טרי </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS-Tween פתרון (PBT) </td><td></td><td> 1xPBS, 0.1% Tween-20 </td><td></td></tr><tr><td> גליצין פתרון </td><td></td><td> 2 מ&quot;ג / המ&quot;ל גליצין בPBT </td><td></td></tr><tr><td> עכבר חד שבטי HRP-מצומדות אנטי DIG </td><td> ג&#39;קסון ImmunoResearch מעבדות Inc </td><td> 200-032 - 156 </td><td> (דילול 1/400 של 1 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון המניות בPBTB </td></tr><tr><td> כבשי HRP-מצומדות אנטי DIG חד שבטיים </td><td> הרוש יישומית Science, Laval, QC </td><td> 1 207 733 </td><td> דילול 1/500 של פתרון המניות בPBTB </td></tr><tr><td> ביוטין מצומדות עכבר חד שבטי אנטי DIG </td><td> ג&#39;קסון ImmunoResearch מעבדות בע&quot;מ, מערב גרוב, פנסילבניה, ארה&quot;ב </td><td> 200-062-156 </td><td> (דילול 1/400 של 1 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון המניות בPBTB </td></tr><tr><td> Streptavidin-HRP הצמוד </td><td> בדיקות מולקולריות, יוג&#39;ין או, ארה&quot;ב </td><td> S991 </td><td> (דילול 1/100 של מניות 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr></tbody></table>

whole mount rna fluorescent in situ hybridization of drosophila embryos

הערכת דפוסי הביטוי של גן, כמו גם את תכונות לוקליזציה subcellular של רנ&quot;א התעתיקים שלה, הן תכונות מרכזיות להבנת התפקוד הביולוגי שלה במהלך פיתוח. רנ&quot;א כלאה באתר (RNA-ish) הוא שיטה חזקה המשמשת להמחשת מאפייני הפצת RNA, יהיה זה ברמת האורגניזם, סלולרית או subcellular 1. RNA-ish מבוסס על הכלאה של חללית שכותרתו חומצות גרעין (למשל antisense RNA, oligonucleotides) משלימה הרצף של mRNA או יעד שאינו קידוד-RNA של עניין 2. כנוהל מחייב מידע רצף ראשוני בלבד כדי ליצור רצף בדיקות ספציפיות, זה יכול להיות מיושם באופן אוניברסלי למגוון רחב של יצורים ודגימות רקמה 3. ואכן, מספר מחקרי איש בקנה מידה גדול יושם לתעד ביטוי גנים ודינמיקת RNA לוקליזציה באורגניזם מודל שונה, מה שהוביל להקמת משאבי קהילה חשובים 4-11. בעוד מגוון של תיוג בדיקה וזיהוי אסטרטגיות פותח לאורך השנים, השימוש בשילוב של חומרים כימיים זיהוי כותרת-fluorescently וצעדי הגברת אותות אנזימטית מציע שיפורים משמעותיים ברגישות וברזולוציה של ההליך 12. כאן, אנו מתארים ניאון מותאם בשיטת כלאה באתר (FISH) העסקת הגברת אות tyramide (TSA) לדמיין ביטוי RNA ודינמיקת לוקליזציה בעוברי תסיסנית מבוימת. ההליך מתבצע ב96-PCR צלחת פורמט היטב, שמאוד מקל על העיבוד בו הזמני של מספר גדול של דגימות.

כאשר בצעו בהצלחה, הליך זה מציע רמה להדהים משופרת של פרטים במרחב ובזמן הניתוח הזמני של ביטוי גנים ודינמיקת לוקליזציה mRNA במהלך ההתפתחות עוברת תסיסנית מוקדם. ואכן, כפי שמודגם באיור 3 א לננס זוג השלטון הגנטי הקלסי (ריצה), ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כד...

Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos at JoVE.com

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

כאן אנו מתארים שלם הר ניאון<em&gt; באתר</em&gt; הכלאת פרוטוקול (דגים) לקביעת מאפייני הביטוי ולוקליזציה של RNAs הביעו במהלך ההתפתחות עוברת בזבוב הפרות,<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em&gt;.

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Research

JoVE Journal

Biology

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

שימוש הר שלם באתרו הכלאה קישור לביולוגיה מולקולרית האורגניזם

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

הר שלם<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של E8.5 לעוברי E11.5 עכבר

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

זיהוי של רנ&quot;א נגיפי על ידי הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

ניתוח של שעתוק גנים מהתא הבודד על ידי RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה (דגים)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

עיתוי מעתיק כרומוזום בשילוב עם פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

רנ&quot;א<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה בעוברי הר שלמים והיסטולוגיה הסלולרית מותאמת לElasmobranchs הימי

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

הר שלם ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה בתוך עוברי דג הזברה לחקר ביטוי גנים ותפקוד

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

ניתוח של אפופטוזיס בעוברי דג הזברה על ידי כל הר Immunofluorescence לזיהוי caspase הופעל 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...