Name: whole mount rna fluorescent in situ hybridization of drosophila embryos
Uploaded: 2013-01-30T13:00:00
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Lavori realizzati in laboratorio Lécuyer è sostenuto da un finanziamento della Nazionale Scienze e Ingegneria Consiglio, del Canada (NSERC), il Canadian Institutes of Health Research (CIHR) e il Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ). Fabio Alexis Lefebvre e Gaël Moquin-Beaudry sono supportati da borse di ricerca NSERC universitari, mentre Carole Iampietro è supportato dalla borsa di studio post-dottorato Angelo Pizzagalli.

1. RNA Probe Preparazione Descrizione: La sezione seguente descrive i passaggi necessari per rendere digossigenina (Dig), sonde di RNA adatta ai pesci. Il primo passo consiste clonazione o PCR amplificazione di una sequenza corrispondente alla regione trascritta di un gene di interesse che verrà utilizzato per generare una sequenza sonda specifica. Ciò può essere ottenuto clonando il primo segmento di gene in un plasmide in cui è affiancato il sito di clonaggio multiplo da...

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	<li>Wilcox, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+principles+of+in+situ+hybridization.">Fundamental principles of in situ hybridization.</a> J. Histochem. 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F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+embryo+dechorionation.">Drosophila embryo dechorionation.</a> CSH Protoc. , (2007).</li><li>Stapleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+gene+collection:+identification+of+putative+full-length+cDNAs+for+70%+of+D.+melanogaster+genes.">The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes.</a> Genome Res. 12, 1294-1300 (2002).</li><li>Rubin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+complementary+DNA+resource.">A Drosophila complementary DNA resource.</a> Science. 287, 2222-2224 (2000).</li><li>Tomancak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+determination+of+patterns+of+gene+expression+during+Drosophila+embryogenesis.">Systematic determination of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis.</a> Genome Biol. 3, (2002).</li><li>Terashima, J., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+available+food+into+the+number+of+eggs+laid+by+Drosophila+melanogaster.">Translating available food into the number of eggs laid by Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 167, 1711-1719 (2004).</li><li>Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. 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Biol. 714, 31-47 (2011).</li><li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846 (2004).</li></ol>

Per la procedura di sintesi della sonda, di solito generano run-off sonde di RNA antisenso mediante trascrizione in vitro da full-length cDNA Drosophila amplificati da plasmidi presenti nel gene Drosophila Collection (DGC), una risorsa dettagliato al seguente indirizzo: <a href="http://www.fruitfly.org/DGC/index.html" target="_blank">http://www .fruitfly.org / DGC / index.html</a> 14,15. Questo approccio è stato ampiamente utilizzato in grandi studi di ISH di scala volte a espressi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> T7, T3 e SP6 RNA polimerasi </td><td> Fermentas Life Sciences </td><td> EP0101, EP0111, EP0131 </td><td> I kit contengono tampone di reazione. </td></tr><tr><td> DIG RNA Labeling Mix </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11 277 073 910 </td><td></td></tr><tr><td> RNAguard </td><td> Amersham Biosciences </td><td> 27-0816-01 </td><td></td></tr><tr><td> 3M sodio acetato </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Freddo etanolo 100%. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Etanolo freddo al 70%. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Soluzione di candeggina al cloro diluito 1:1 con acqua. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Eptano </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Metanolo </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> proteinasi K </td><td> Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada </td><td> Catalog No. P2308 </td><td></td></tr><tr><td> Soluzione al 40% di formaldeide, preparata </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS-Tween soluzione (PBT) </td><td></td><td> 1xPBS, 0,1% Tween-20 </td><td></td></tr><tr><td> Glycine soluzione </td><td></td><td> 2 mg / ml di glicina in PBT </td><td></td></tr><tr><td> HRP-coniugato monoclonale di topo anti-DIG </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc </td><td> 200-032 - 156 </td><td> (1/400 di una diluizione 1 mg / ml di soluzione concentrata in PBTB </td></tr><tr><td> HRP-coniugato pecore monoclonale anti-DIG </td><td> Roche Applied Sciencece, Laval, QC </td><td> 1 207 733 </td><td> 1/500 di diluizione della soluzione di riserva in PBTB </td></tr><tr><td> Biotina-coniugato monoclonale di topo anti-DIG </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, Stati Uniti d&#39;America </td><td> 200-062-156 </td><td> (1/400 di una diluizione 1 mg / ml di soluzione concentrata in PBTB </td></tr><tr><td> Streptavidina-HRP coniugato </td><td> Molecular Probes, Eugene, USA </td><td> S991 </td><td> (Diluizione 1/100 di una mcg / ml 1 stock </td></tr></tbody></table>

whole mount rna fluorescent in situ hybridization of drosophila embryos

Valutare il pattern di espressione di un gene, come pure le proprietà localizzazione subcellulare di suo RNA trascritti, sono caratteristiche essenziali per la comprensione della funzione biologica durante lo sviluppo. RNA ibridazione in situ (ISH-RNA) è un potente metodo utilizzato per visualizzare le proprietà di distribuzione di RNA, sia ai organismal, livelli cellulari o subcellulari 1. RNA-ISH si basa sulla ibridazione di una sonda di acido nucleico marcato (ad esempio RNA antisenso, oligonucleotidi) complementare alla sequenza di un mRNA o non codificante RNA bersaglio di interesse 2. Poiché la procedura richiede informazioni di sequenza primaria sola sequenza per generare sonde specifiche, può essere universalmente applicata a una vasta gamma di organismi e campioni di tessuto 3. Infatti, un certo numero di studi ISH larga scala sono state attuate per documentare l&#39;espressione genica e RNA dinamiche localizzazione in vari organismi modello, che ha portato allacreazione di risorse comunitarie importanti 4-11. Mentre una serie di etichettatura sonda e strategie di rilevazione sono state sviluppate nel corso degli anni, l&#39;uso combinato di reagenti di rivelazione in fluorescenza marcati enzimatici e di amplificazione di segnale offrono miglioramenti significativi della sensibilità e risoluzione del procedimento 12. Qui, descriviamo un metodo fluorescente ottimizzata in ibridazione in situ (FISH) utilizzando l&#39;amplificazione del segnale tiramide (TSA) per visualizzare l&#39;espressione di RNA e dinamica in scena localizzazione in embrioni di Drosophila. La procedura viene eseguita in formato a 96 pozzetti piastra PCR, che facilita notevolmente la lavorazione simultanea di un gran numero di campioni.

Se eseguito con successo, questa procedura offre un livello sorprendentemente maggiore di dettaglio spazio-temporale analisi dell&#39;espressione genica e della dinamica di localizzazione di mRNA durante i primi embriogenesi Drosophila. Infatti, come illustrato nella figura 3A per la classica coppia di regola-runt gene (pista), si può usare questo protocollo per osservare eventi di espressione genica attraverso l&#39;individuazione dei focolai trascritto nascente in gruppi di...

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Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Qui si descrive un insieme di montaggio fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione (FISH) protocollo per la determinazione delle proprietà di espressione e la localizzazione di RNA espressi durante l&#39;embriogenesi nel moscerino della frutta,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

Tutta la Monte RNA fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; L&#39;ibridazione di<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

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