Name: whole mount rna fluorescent in situ hybridization of drosophila embryos
Uploaded: 2013-01-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos at JoVE.com

Lécuyer 실험실에서 실시 작품은 국립 과학 캐나다의 공학 협의회 (NSERC), 건강 연구 (CIHR)와 Fonds 드 공들인 실내 Santé 뒤 퀘벡 (FRSQ)의 캐나다 연구소에서 자금을 지원합니다. 캐롤 Iampietro는 안젤로 Pizzagalli 박사 교제를 지원하는 동안 파비오 알렉시스 Lefebvre와 게일 Moquin - Beaudry은 NSERC 학부 연구 studentships에 의해 지원됩니다.

1. RNA 프로브 준비 개요 : 다음 섹션은 물고기에 적합한 Digoxigenin (해봐)이라는 RNA 프로브를 만들기 위해 필요한 단계를 설명합니다. 첫 번째 단계는 복제 또는 시퀀스 특정 프로브를 생성하는 데 사용됩니다 관심있는 유전자의 베꼈 지역에 해당하는 순서를 증폭 PCR 포함됩니다. 이것은 여러 복제 사이트는 다음 발기인 시퀀스를 통합 측면을 노릴 프리 머를 사용하?...

<ol>
	<li>Wilcox, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+principles+of+in+situ+hybridization.">Fundamental principles of in situ hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 41, 1725-1733 (1993).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98, 81-85 (1989).</li><li>Lecuyer, E., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+gene+expression+universe.">Mapping the gene expression universe.</a> Curr Opin Genet Dev. 18, 506-512 (2008).</li><li>Tomancak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+patterns+of+gene+expression+during+Drosophila+embryogenesis.">Global analysis of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis.</a> Genome Biol. 8, 2007-208 (2007).</li><li>Thisse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+expression+of+the+zebrafish+genome+by+large-scale+in+situ+hybridization+screening.">Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening.</a> Methods Cell Biol. 77, 505-519 (2004).</li><li>Quiring, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization.">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).</li><li>Pollet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+differential+gene+expression+during+early+Xenopus+embryogenesis.">An atlas of differential gene expression during early Xenopus embryogenesis.</a> Mech. Dev. 122, 365-439 (2005).</li><li>Lein, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain.">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445, 168-176 (2007).</li><li>Lecuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li><li>Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+blueprint+for+a+chordate+embryo.">Regulatory blueprint for a chordate embryo.</a> Science. 312, 1183-1187 (2006).</li><li>Bell, G. W., Yatskievych, T. A., Antin, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEISHA,+a+whole-mount+in+situ+hybridization+gene+expression+screen+in+chicken+embryos.">GEISHA, a whole-mount in situ hybridization gene expression screen in chicken embryos.</a> Dev. Dyn. 229, 677-687 (2004).</li><li>Wilkie, G. S., Shermoen, A. W., O'Farrell, P. H., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcribed+genes+are+localized+according+to+chromosomal+position+within+polarized+Drosophila+embryonic+nuclei.">Transcribed genes are localized according to chromosomal position within polarized Drosophila embryonic nuclei.</a> Curr. Biol. 9, 1263-1266 (1999).</li><li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+embryo+dechorionation.">Drosophila embryo dechorionation.</a> CSH Protoc. , (2007).</li><li>Stapleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+gene+collection:+identification+of+putative+full-length+cDNAs+for+70%+of+D.+melanogaster+genes.">The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes.</a> Genome Res. 12, 1294-1300 (2002).</li><li>Rubin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+complementary+DNA+resource.">A Drosophila complementary DNA resource.</a> Science. 287, 2222-2224 (2000).</li><li>Tomancak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+determination+of+patterns+of+gene+expression+during+Drosophila+embryogenesis.">Systematic determination of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis.</a> Genome Biol. 3, (2002).</li><li>Terashima, J., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+available+food+into+the+number+of+eggs+laid+by+Drosophila+melanogaster.">Translating available food into the number of eggs laid by Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 167, 1711-1719 (2004).</li><li>Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+protocols+in+Drosophila+embryos+and+tissues.">Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues.</a> Methods Mol. Biol. 420, 289-302 (2008).</li><li>Lecuyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+fluorescent+in+situ+hybridization+in+Drosophila.">High resolution fluorescent in situ hybridization in Drosophila.</a> Methods Mol. Biol. 714, 31-47 (2011).</li><li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846 (2004).</li></ol>

프로브 합성 단계의 경우, 우리는 일반적으로 Drosophila 유전자 컬렉션 (DGC), 다음 웹 사이트에서 설명하는 자원에서 발견 plasmids의 증폭 전체 길이 Drosophila의 cDNAs에서 체외 스크립트에 의해 실행 - 오프 안티센스 RNA 프로브를 생성 : <a href="http://www.fruitfly.org/DGC/index.html" target="_blank">http://www .fruitfly.org / DGC / index.html 페이지</a> 14,15. 이 접근 방식은 플라이 배아 9,16의</su...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> T7, T3 또는 SP6 RNA 중합 효소의 </td><td> Fermentas 생명 과학 </td><td> EP0101, EP0111, EP0131 </td><td> 키트는 반응 버퍼가 포함되어 있습니다. </td></tr><tr><td> 파 RNA 라벨 믹스 </td><td> 로슈 응용 과학 </td><td> 11 277 073 910 </td><td></td></tr><tr><td> RNAguard </td><td> Amersham Biosciences </td><td> 27-0816-01 </td><td></td></tr><tr><td> 3M의 아세트산 나트륨 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 차가운 100 % 에탄올. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 차가운 70 % 에탄올. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 염소 표백제 솔루션은 물과 1:1 희석. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 헵탄 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 메타놀 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> proteinase K </td><td> 시그마 알드리치 옥빌, ON, 캐나다 </td><td> 카탈로그 번호 P2308 </td><td></td></tr><tr><td> 40 % 포름 알데히드 용액, 신선한 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS-십대 초반 솔루션 (PBT) </td><td></td><td> 1xPBS, 0.1 % 십대 초반-20 </td><td></td></tr><tr><td> 글리신 솔루션 </td><td></td><td> PBT에서 2 밀리그램 / ML 글리신 </td><td></td></tr><tr><td> 단클론 HRP-복합 마우스 안티 - 파 </td><td> 잭슨 ImmunoResearch 연구소 주식회사 </td><td> 200-032 - 156 </td><td> (PBTB의 1 MG / ML 주식 솔루션의 400분의 1 희석 </td></tr><tr><td> HRP-복합 양 안티 - 파 단클론 </td><td> 로슈 응용 ScienCE, 라발, QC </td><td> 1 207 733 </td><td> PBTB의 주식 솔루션의 5백분의 1 희석 </td></tr><tr><td> 비오틴 - 복합 마우스 단클론 항 파 </td><td> 잭슨 ImmunoResearch 연구소 주식회사, 웨스트 그 로브, PA, USA </td><td> 200-062-156 </td><td> (PBTB의 1 MG / ML 주식 솔루션의 400분의 1 희석 </td></tr><tr><td> Streptavidin-HRP 공액 </td><td> 분자 프로브, 유진 OR, USA </td><td> S991 </td><td> (1 μg / ML 주식 100분의 1 희석 </td></tr></tbody></table>

whole mount rna fluorescent in situ hybridization of drosophila embryos

유전자뿐만 아니라 베꼈 RNA의 subcellular 지방화 속성의 표현 패턴을 평가하는 것은 개발 과정의 생물학적 기능을 이해하기위한 핵심 기능입니다. 현장 하이브리드 화의 RNA (RNA 살쯤)는 RNA 배포 속성을 시각화하는 데 사용되는 강력한 방법입니다, organismal, 휴대 또는 subcellular 레벨 1에서합니다. RNA 살쯤는 mRNA 또는 관심 (2)의 비 코딩 RNA 대상의 순서를 보완이라는 핵산 산 프로브 (예 : 안티센스 RNA, oligonucleotides)의 하이브리드에 기반을두고 있습니다. 프로 시저가 순서 특정 프로브를 생성 할 만 기본 순서 정보를 필요에 따라, 그것은 보편적 생물과 조직 표본 3의 광범위한 적용 할 수 있습니다. 사실, 대규모 틱 연구 번호가 유전자 발현을 문서화하고 다양한 모델 생물에서 현지화 역학을 RNA하기 위해 구현되었으며, 이는하게되었다중요 지역 사회 자원 4-11의 설립. 프로브 라벨 및 검색 전략의 다양한이 년 동안 개발 된 반면, 휘황-라벨 감지 시약 및 효소 신호 증폭 단계의 결합 사용은 절차 12 감도와 해상도에 상당한 향상을 제공합니다. 여기, 우리는 무대 Drosophila의 배아에서 RNA의 발현 및 현지화 역학을 시각화하는 tyramide 신호 증폭 (TSA)을 채용 원위치 하이브리드 화 방법 (물고기)에 최적화 된 형광을 설명합니다. 절차는 크게 샘플을 다수의 동시 처리를 용이하게 96도 PCR 플레이트 형식으로 수행됩니다.

성공적으로 수행되면,이 절차는 초기 Drosophila의 embryogenesis 동안 유전자 발현 및 mRNA의 현지화 역학의 spatio - 시간적 분석의 상세 놀랍도록 향상된 수준을 제공합니다. 클래식 쌍 - 규칙 유전자 꼬마 (실행)를도 3a에 도시 된 바와 같이 실제로, 하나는 핵을 표현 그룹의 초기 스크립트 foci의 검출을 통해 유전자 발현 이벤트를 관찰 할이 프로토콜을 사용할 수 있습니?...

Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos at JoVE.com

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

여기 우리는 전체 마운트 형광을 설명<em&gt; 현장에서</em과일 플라이의 embryogenesis 동안 표현 RNAs의 표현 및 현지화 특성을 결정하기위한&gt; 하이브리드 (물고기) 프로토콜,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

전체 마운트 RNA 형광<em&gt; 현장에서</em의&gt; 하이브리드<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Research

JoVE Journal

Biology

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

연구

생물학

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

전체 마운트를 사용하여 현장에서</em분자 생물학과 Organismal를 링크> 하이브 리다이 제이션

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

전체 산<em&gt; 현장에서</emE11.5 마우스 태아에 E8.5의&gt; 하이브리드

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

RNA 형광하여 단일 세포 유전자 전사의 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 (물고기)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

형광등과 결합 염색체 복제 타이밍<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA<em&gt; 현장에서</em전체 마운트 태아 및 세포 조직학에서&gt; 하이브리드는 해양 Elasmobranchs을위한 적응

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

높은 해상도 전체 마운트<em&gt; 제자리에서</em유전자 발현 및 기능을 연구하는 제브라 피쉬 배아에서&gt; 하이브리드

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...