Name: whole mount rna fluorescent in situ hybridization of drosophila embryos
Uploaded: 2013-01-30T13:00:00
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Trabalho realizado no laboratório Lecuyer é suportado por financiamento do Conselho Nacional e Ciências da Engenharia do Canadá (NSERC), o Canadian Institutes of Health Research (CIHR) e do Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ). Fabio Alexis Lefebvre e Gaël Moquin-Beaudry são suportados por NSERC bolseiros de iniciação científica, enquanto Carole Iampietro é suportado pela irmandade Pizzagalli Angelo pós-doutorado.

1. Preparação da sonda de ARN Resumo: A seção seguinte descreve os passos necessários para fazer sondas digoxigenina (Dig)-rotulados de RNA suficiente para os peixes. O primeiro passo envolve a clonagem ou PCR amplificar uma sequência correspondente à região transcrita de um gene de interesse que irá ser utilizado para gerar uma sonda específica da sequência. Isto pode ser conseguido por clonagem do primeiro segmento de gene em um plasmídeo no qual o sítio de clon...

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	<li>Wilcox, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+principles+of+in+situ+hybridization.">Fundamental principles of in situ hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 41, 1725-1733 (1993).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98, 81-85 (1989).</li><li>Lecuyer, E., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+gene+expression+universe.">Mapping the gene expression universe.</a> Curr Opin Genet Dev. 18, 506-512 (2008).</li><li>Tomancak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+patterns+of+gene+expression+during+Drosophila+embryogenesis.">Global analysis of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis.</a> Genome Biol. 8, 2007-208 (2007).</li><li>Thisse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+expression+of+the+zebrafish+genome+by+large-scale+in+situ+hybridization+screening.">Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening.</a> Methods Cell Biol. 77, 505-519 (2004).</li><li>Quiring, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization.">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. 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Biol. 714, 31-47 (2011).</li><li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846 (2004).</li></ol>

Para as etapas de síntese da sonda, que normalmente geram o escoamento sondas antisense RNA por transcrição in vitro a partir de cDNAs completos Drosophila amplificados de plasmídeos encontrados no gene Drosophila Collection (DGC), um recurso detalhada no site: <a href="http://www.fruitfly.org/DGC/index.html" target="_blank">http://www .fruitfly.org / DGC / index.html</a> 14,15. Esta abordagem tem sido amplamente utilizado em estudos de grande escala ISH destinadas a ex...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> T7, T3 ou SP6 RNA polimerase </td><td> Fermentas Life Sciences </td><td> EP0101, EP0111, EP0131 </td><td> Kits contêm tampão de reacção. </td></tr><tr><td> DIG RNA Labeling Mix </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11 277 073 910 </td><td></td></tr><tr><td> RNAguard </td><td> Amersham Biosciences </td><td> 27-0816-01 </td><td></td></tr><tr><td> Acetato de sódio 3M </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Etanol a 100% frio. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Etanol a 70% frio. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Solução de lixívia de cloro diluído 1:1 com água. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Heptano </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> proteinase K </td><td> Sigma Aldrich Oakville, Ontário, Canadá </td><td> Catalog No. P2308 </td><td></td></tr><tr><td> Solução de formaldeído a 40%, recentemente preparada </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS-Tween (PBT) </td><td></td><td> 1xPBS, 0,1% de Tween-20 </td><td></td></tr><tr><td> Glicina solução </td><td></td><td> 2 mg / ml de glicina em PBT </td><td></td></tr><tr><td> HRP conjugada com anticorpo monoclonal de ratinho anti-DIG </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc </td><td> 200-032 - 156 </td><td> (1/400 de uma diluição de 1 mg / ml de solução concentrada de PBTB </td></tr><tr><td> HRP-conjugado ovelha monoclonal anti-DIG </td><td> Roche Applied Science, Laval, QC </td><td> 1 207 733 </td><td> 1/500 diluição da solução de reserva em PBTB </td></tr><tr><td> A biotina conjugada com anticorpo monoclonal de ratinho anti-DIG </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, EUA </td><td> 200-062-156 </td><td> (1/400 de uma diluição de 1 mg / ml de solução concentrada de PBTB </td></tr><tr><td> Estreptavidina-HRP conjugado </td><td> Molecular Probes, Eugene OR, EUA </td><td> S991 </td><td> (Diluição 1/100 de um estoque 1 ug / ml </td></tr></tbody></table>

whole mount rna fluorescent in situ hybridization of drosophila embryos

Avaliar o padrão de expressão de um gene, assim como as propriedades de localização subcelular dos seus transcritos de ARN, são características chave para a compreensão da sua função biológica durante o desenvolvimento. RNA de hibridação in situ (RNA-ISH) é um poderoso método utilizado para visualização de propriedades de distribuição de RNA, seja nos organismos, níveis celulares ou subcelular 1. RNA-ISH baseia-se na hibridação de uma sonda marcada de ácido nucleico (por exemplo, ARN anti-sentido, oligonucleótidos) complementar à sequência de um mRNA ou de um não-codificantes de ARN alvo de interesse 2. À medida que o processo requer a informação de sequência primária sozinho para gerar sondas específicas de sequência, pode ser universalmente aplicado a uma ampla gama de organismos e amostras de tecido 3. De facto, uma série de estudos de grande escala ISH foram implementados para documentar a expressão do gene de ARN e dinâmica de localização em vários organismos modelo, o que levou àestabelecimento de recursos comunitários importantes 4-11. Embora uma variedade de etiquetagem da sonda e estratégias de detecção têm sido desenvolvidos ao longo dos anos, o uso combinado de reagentes de detecção marcados por fluorescência e as etapas de amplificação enzimática de sinal oferecem melhorias significativas na sensibilidade e resolução do processo 12. Aqui, nós descrevemos um método fluorescente optimizado em hibridização in situ (FISH) utilizando amplificação de sinal de tiramida (TSA) para visualizar a expressão de RNA e da dinâmica de localização em embriões de Drosophila faseados. O procedimento é realizado em formato de 96 poços da placa de PCR, o que facilita grandemente o processamento simultâneo de um grande número de amostras.

Quando realizada com sucesso, este procedimento oferece um nível notavelmente melhorada de detalhe na análise espaço-temporal da expressão gênica e dinâmica de localização de mRNA durante a embriogênese Drosophila cedo. De fato, como ilustrado na Figura 3A para o nanico gene clássico par-regra (pista), pode-se usar este protocolo para observar eventos de expressão gênica por meio da detecção de focos transcrição nascente em grupos de núcleos expressando. Além...

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Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Aqui nós descrevemos um fluorescente todo-mount<em&gt; In situ</em&gt; Protocolo de hibridização (FISH) para determinar as propriedades de expressão e localização de RNAs expressas durante a embriogênese na mosca da fruta,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

Todo o Monte RNA Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; A hibridação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

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Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

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Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Tempo cromossomo Replicando Combinado com Fluorescente<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

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RNA<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridação em embriões de Mount inteiros e histologia de células Adaptado para Elasmobrânquios Marinhos

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

Alta resolução Monte Whole<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização dentro embriões Zebrafish para estudar a expressão gênica e função

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Análise de apoptose em embriões Zebrafish por Whole-mount imunofluorescência para detectar Caspase 3 ativado

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...