Name: whole mount rna fluorescent in situ hybridization of drosophila embryos
Uploaded: 2013-01-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos at JoVE.com

El trabajo realizado en el laboratorio Lécuyer con el apoyo de fondos de la Nacional de Ciencias e Ingeniería de Canadá (NSERC), los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) y el Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ). Fabio Alexis Lefebvre y Gaël Moquin-Beaudry son apoyados por NSERC becas de investigación de pregrado, mientras que Carole Iampietro con el apoyo de la beca postdoctoral Pizzagalli Angelo.

1. Sonda de ARN Preparación Resumen: En la siguiente sección se describen los pasos necesarios para hacer digoxigenina (DIG)-etiquetados sondas de ARN para el pescado. El primer paso implica la clonación o la PCR de la secuencia correspondiente a la región transcrita de un gen de interés que se utilizará para generar una sonda específica de secuencia. Esto se puede lograr por clonación primero el segmento de gen en un plásmido en el que está flanqueado el sitio de cl...

<ol>
	<li>Wilcox, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+principles+of+in+situ+hybridization.">Fundamental principles of in situ hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 41, 1725-1733 (1993).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98, 81-85 (1989).</li><li>Lecuyer, E., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+gene+expression+universe.">Mapping the gene expression universe.</a> Curr Opin Genet Dev. 18, 506-512 (2008).</li><li>Tomancak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+patterns+of+gene+expression+during+Drosophila+embryogenesis.">Global analysis of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis.</a> Genome Biol. 8, 2007-208 (2007).</li><li>Thisse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+expression+of+the+zebrafish+genome+by+large-scale+in+situ+hybridization+screening.">Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening.</a> Methods Cell Biol. 77, 505-519 (2004).</li><li>Quiring, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization.">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).</li><li>Pollet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+differential+gene+expression+during+early+Xenopus+embryogenesis.">An atlas of differential gene expression during early Xenopus embryogenesis.</a> Mech. Dev. 122, 365-439 (2005).</li><li>Lein, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain.">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445, 168-176 (2007).</li><li>Lecuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li><li>Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+blueprint+for+a+chordate+embryo.">Regulatory blueprint for a chordate embryo.</a> Science. 312, 1183-1187 (2006).</li><li>Bell, G. W., Yatskievych, T. A., Antin, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEISHA,+a+whole-mount+in+situ+hybridization+gene+expression+screen+in+chicken+embryos.">GEISHA, a whole-mount in situ hybridization gene expression screen in chicken embryos.</a> Dev. Dyn. 229, 677-687 (2004).</li><li>Wilkie, G. S., Shermoen, A. W., O'Farrell, P. H., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcribed+genes+are+localized+according+to+chromosomal+position+within+polarized+Drosophila+embryonic+nuclei.">Transcribed genes are localized according to chromosomal position within polarized Drosophila embryonic nuclei.</a> Curr. Biol. 9, 1263-1266 (1999).</li><li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+embryo+dechorionation.">Drosophila embryo dechorionation.</a> CSH Protoc. , (2007).</li><li>Stapleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+gene+collection:+identification+of+putative+full-length+cDNAs+for+70%+of+D.+melanogaster+genes.">The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes.</a> Genome Res. 12, 1294-1300 (2002).</li><li>Rubin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+complementary+DNA+resource.">A Drosophila complementary DNA resource.</a> Science. 287, 2222-2224 (2000).</li><li>Tomancak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+determination+of+patterns+of+gene+expression+during+Drosophila+embryogenesis.">Systematic determination of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis.</a> Genome Biol. 3, (2002).</li><li>Terashima, J., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+available+food+into+the+number+of+eggs+laid+by+Drosophila+melanogaster.">Translating available food into the number of eggs laid by Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 167, 1711-1719 (2004).</li><li>Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+protocols+in+Drosophila+embryos+and+tissues.">Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues.</a> Methods Mol. Biol. 420, 289-302 (2008).</li><li>Lecuyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+fluorescent+in+situ+hybridization+in+Drosophila.">High resolution fluorescent in situ hybridization in Drosophila.</a> Methods Mol. Biol. 714, 31-47 (2011).</li><li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846 (2004).</li></ol>

Para ver los pasos de síntesis de la sonda, que suelen generar escorrentía antisentido sondas de ARN por transcripción in vitro de larga duración cDNAs amplificados a partir de plásmidos de Drosophila se encuentran en la Colección de Drosophila Gene (DGC), un recurso detalla en la siguiente dirección: <a href="http://www.fruitfly.org/DGC/index.html" target="_blank">http:// .fruitfly.org / DGC / index.html</a> 14,15. Este enfoque ha sido utilizado ampliamente en estud...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> T7, la ARN polimerasa T3 o SP6 </td><td> Fermentas Ciencias de la Vida </td><td> EP0101, EP0111, EP0131 </td><td> Los kits contienen tampón de reacción. </td></tr><tr><td> DIG RNA Labeling Mix </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11 277 073 910 </td><td></td></tr><tr><td> RNAguard </td><td> Amersham Biosciences </td><td> 27-0816-01 </td><td></td></tr><tr><td> Acetato sódico 3 M </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Etanol frío al 100%. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Etanol frío al 70%. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Solución de lejía diluida 1:1 con agua. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Heptano </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> proteinasa K </td><td> Sigma Aldrich Oakville, ON, Canadá </td><td> N º de catálogo P2308 </td><td></td></tr><tr><td> 40% solución de formaldehído, recién preparado </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS-Tween solución (PBT) </td><td></td><td> 1xPBS, 0,1% de Tween-20 </td><td></td></tr><tr><td> Glicina solución </td><td></td><td> 2 mg / ml de glicina en PBT </td><td></td></tr><tr><td> HRP-conjugado monoclonal de ratón anti-DIG </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc </td><td> 200-032 - 156 </td><td> (1/400 de dilución de un 1 mg / ml de solución madre en PBTB </td></tr><tr><td> HRP de oveja conjugado monoclonal anti-DIG </td><td> Roche Applied Science, Laval, QC </td><td> 1 207 733 </td><td> Dilución 1/500 de la solución madre en PBTB </td></tr><tr><td> Biotina conjugada con anticuerpo monoclonal de ratón anti-DIG </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, EE.UU. </td><td> 200-062-156 </td><td> (1/400 de dilución de un 1 mg / ml de solución madre en PBTB </td></tr><tr><td> Estreptavidina-HRP conjugado </td><td> Molecular Probes, Eugene OR, EE.UU. </td><td> S991 </td><td> (1/100 de dilución de un 1 mg / ml de solución madre </td></tr></tbody></table>

whole mount rna fluorescent in situ hybridization of drosophila embryos

Evaluar el patrón de expresión de un gen, así como las propiedades de localización subcelular de sus ARN transcrito, son características clave para la comprensión de su función biológica durante el desarrollo. ARN hibridación in situ (ISH-RNA) es un poderoso método utilizado para la visualización de las propiedades de ARN de distribución, ya sea a nivel organismal, celular o subcelular 1. ARN-ISH se basa en la hibridación de una sonda de ácido nucleico marcada (por ejemplo, ARN antisentido, oligonucleótidos) complementaria a la secuencia de un ARNm o un objetivo no codificante de ARN de interés 2. A medida que el procedimiento requiere información de la secuencia primaria por sí sola para generar sondas específicas de secuencia, que puede aplicarse universalmente a una amplia gama de organismos y muestras de tejido 3. De hecho, un número de estudios a gran escala ISH se han implementado para documentar la expresión génica y ARN dinámica de localización en diversos organismos modelo, que ha llevado a laestablecimiento de recursos comunitarios importantes 4-11. Mientras que una variedad de la sonda de etiquetado y estrategias de detección se han desarrollado a lo largo de los años, el uso combinado de los reactivos de detección marcadas con fluorescencia y enzimáticas pasos de amplificación de señal ofrecen mejoras significativas en la sensibilidad y la resolución del procedimiento 12. A continuación, describimos un fluorescente optimizado método de hibridación in situ (FISH) utilizando amplificación de la señal tiramida (TSA) para visualizar la expresión del ARN y la dinámica de localización en una puesta de embriones de Drosophila. El procedimiento se lleva a cabo en 96-y formato de placa de PCR, lo que facilita en gran medida el procesamiento simultáneo de grandes números de muestras.

Si se realiza con éxito, este procedimiento ofrece un nivel notablemente mejorada de detalle en el análisis espacio-temporal de la expresión génica y la dinámica de localización de mRNA a principios de la embriogénesis de Drosophila. En efecto, como se ilustra en la Figura 3 para el más pequeño de genes clásico par-rule (pista), se puede usar este protocolo para observar eventos de expresión génica a través de la detección de focos de transcripci...

Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos at JoVE.com

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Aquí se describe un fluorescente de todo el montaje<em&gt; In situ</em&gt; Hibridación (FISH) protocolo para determinar las propiedades de expresión y localización de ARN expresados ​​durante la embriogénesis en la mosca de la fruta,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

Todo el monte ARN fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Research

JoVE Journal

Biology

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Monte doble entero hibridación in situ de embriones de pollo temprano

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Investigación

Biología

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Pez cebra todo el montaje de alta resolución doble fluorescente In Situ La hibridación

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Todo el montaje utilizando In situ La hibridación de Enlace de Organismos y Biología Molecular

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Todo el monte In Situ La hibridación de E8.5 a E11.5 embriones de ratón

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

La detección de ARN viral por fluorescencia<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Análisis de la transcripción de genes de una sola célula de ARN fluorescente<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Replicación del cromosoma Timing Combinado con fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

ARN<em&gt; In situ</emHibridación&gt; Los embriones en todo el montaje y la histología de células Adaptado para elasmobranquios marinos

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

Alta resolución todo el montaje de<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en embriones de pez cebra para estudiar la expresión génica y la función

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Análisis de la apoptosis en embriones de pez cebra en Todo el montaje de inmunofluorescencia para detectar la caspasa 3 activada

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...