Name: whole mount rna fluorescent in situ hybridization of drosophila embryos
Uploaded: 2013-01-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos at JoVE.com

Arbetet utförs i LÉCUYER laboratoriet stöds av medel från National Sciences och teknik Council of Canada (NSERC), den kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR) och Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ). Fabio Alexis Lefebvre och Gaël Moquin-Beaudry stöds av NSERC grundutbildningen forskning doktorandtjänster, medan Carole Iampietro stöds av Angelo Pizzagalli postdoktorsstipendium.

1. RNA-sond Framställning Översikt: Följande avsnitt beskriver de steg som krävs för att göra digoxigenin (dig)-märkta RNA-sonder som lämpar sig för FISH. Det första steget involverar kloning eller PCR amplifiering av en sekvens som motsvarar den transkriberade regionen av en gen av intresse som kommer att användas för att generera en sekvens-specifik sond. Detta kan uppnås genom att först klona gensegmentet i en plasmid i vilken det multipla kloningsstället fla...

<ol>
	<li>Wilcox, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+principles+of+in+situ+hybridization.">Fundamental principles of in situ hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 41, 1725-1733 (1993).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98, 81-85 (1989).</li><li>Lecuyer, E., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+gene+expression+universe.">Mapping the gene expression universe.</a> Curr Opin Genet Dev. 18, 506-512 (2008).</li><li>Tomancak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+patterns+of+gene+expression+during+Drosophila+embryogenesis.">Global analysis of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis.</a> Genome Biol. 8, 2007-208 (2007).</li><li>Thisse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+expression+of+the+zebrafish+genome+by+large-scale+in+situ+hybridization+screening.">Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening.</a> Methods Cell Biol. 77, 505-519 (2004).</li><li>Quiring, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization.">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).</li><li>Pollet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+differential+gene+expression+during+early+Xenopus+embryogenesis.">An atlas of differential gene expression during early Xenopus embryogenesis.</a> Mech. Dev. 122, 365-439 (2005).</li><li>Lein, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain.">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445, 168-176 (2007).</li><li>Lecuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li><li>Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+blueprint+for+a+chordate+embryo.">Regulatory blueprint for a chordate embryo.</a> Science. 312, 1183-1187 (2006).</li><li>Bell, G. W., Yatskievych, T. A., Antin, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEISHA,+a+whole-mount+in+situ+hybridization+gene+expression+screen+in+chicken+embryos.">GEISHA, a whole-mount in situ hybridization gene expression screen in chicken embryos.</a> Dev. Dyn. 229, 677-687 (2004).</li><li>Wilkie, G. S., Shermoen, A. W., O'Farrell, P. H., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcribed+genes+are+localized+according+to+chromosomal+position+within+polarized+Drosophila+embryonic+nuclei.">Transcribed genes are localized according to chromosomal position within polarized Drosophila embryonic nuclei.</a> Curr. Biol. 9, 1263-1266 (1999).</li><li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+embryo+dechorionation.">Drosophila embryo dechorionation.</a> CSH Protoc. , (2007).</li><li>Stapleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+gene+collection:+identification+of+putative+full-length+cDNAs+for+70%+of+D.+melanogaster+genes.">The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes.</a> Genome Res. 12, 1294-1300 (2002).</li><li>Rubin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+complementary+DNA+resource.">A Drosophila complementary DNA resource.</a> Science. 287, 2222-2224 (2000).</li><li>Tomancak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+determination+of+patterns+of+gene+expression+during+Drosophila+embryogenesis.">Systematic determination of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis.</a> Genome Biol. 3, (2002).</li><li>Terashima, J., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+available+food+into+the+number+of+eggs+laid+by+Drosophila+melanogaster.">Translating available food into the number of eggs laid by Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 167, 1711-1719 (2004).</li><li>Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+protocols+in+Drosophila+embryos+and+tissues.">Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues.</a> Methods Mol. Biol. 420, 289-302 (2008).</li><li>Lecuyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+fluorescent+in+situ+hybridization+in+Drosophila.">High resolution fluorescent in situ hybridization in Drosophila.</a> Methods Mol. Biol. 714, 31-47 (2011).</li><li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846 (2004).</li></ol>

För steg probe syntes skapar vi vanligtvis run-off antisens RNA-sonder genom in vitro transkription från hellånga Drosophila cDNA förstärkta från plasmider finns i Drosophila gensamlingen (DGC), en resurs som beskrivs på följande webbplats: <a href="http://www.fruitfly.org/DGC/index.html" target="_blank">http://www .fruitfly.org / DGC / index.html</a> 14,15. Detta tillvägagångssätt har använts i stor utsträckning i stora studier skala ISH syftar till att kartlägga genu...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på reagens </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (tillval) </td></tr><tr><td> T7, T3 eller SP6 RNA-polymeras </td><td> Fermentas Life Sciences </td><td> EP0101, EP0111, EP0131 </td><td> Kit innehåller reaktionsbuffert. </td></tr><tr><td> DIG-RNA Märkning Mix </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11 277 073 910 </td><td></td></tr><tr><td> RNAguard </td><td> Amersham Biosciences </td><td> 27-0816-01 </td><td></td></tr><tr><td> 3M natriumacetat </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kall 100% etanol. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kall 70% etanol. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Klorblekmedel lösning spädd 1:1 med vatten. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Heptan </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> proteinas K </td><td> Sigma Aldrich Oakville, ON, Kanada </td><td> Katalog-nr P2308 </td><td></td></tr><tr><td> 40% formaldehydlösning, nyberedd </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS-Tween-lösning (PBT) </td><td></td><td> 1 x PBS, 0,1% Tween-20 </td><td></td></tr><tr><td> Glycin-lösning </td><td></td><td> 2 mg / ml glycin i PBT </td><td></td></tr><tr><td> HRP-konjugerat mus-monoklonal anti-DIG </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc </td><td> 200-032 - 156 </td><td> (1/400 spädning av en 1 mg / ml förrådslösning i PBTB </td></tr><tr><td> HRP-konjugerat får-monoklonal anti-DIG </td><td> Roche Applied Science, Laval, QC </td><td> 1 207 733 </td><td> 1/500 utspädning av stamlösning i PBTB </td></tr><tr><td> Biotin-konjugerad mus-monoklonal anti-DIG </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA </td><td> 200-062-156 </td><td> (1/400 spädning av en 1 mg / ml förrådslösning i PBTB </td></tr><tr><td> Streptavidin-HRP-konjugat </td><td> Molecular Probes, Eugene OR, USA </td><td> S991 </td><td> (1/100 utspädning av en 1 pg / ml stamlösning </td></tr></tbody></table>

whole mount rna fluorescent in situ hybridization of drosophila embryos

Bedöma uttrycksmönstret av en gen, liksom subcellulära egenskaper lokalisering av dess transkriberade RNA är viktiga egenskaper för att förstå dess biologiska funktion under utveckling. RNA in situ hybridisering (RNA-ish) är en kraftfull metod som används för att visualisera RNA fördelning egenskaper, oavsett om det vid organismbiologi, cellulära eller subcellulära nivå 1. RNA-ISH är baserad på hybridiseringen av en märkt nukleinsyrasond (t ex antisens-RNA, oligonukleotider) komplementär till sekvensen av ett mRNA eller ett icke-kodande RNA-mål av intresse 2. Eftersom förfarandet kräver primära sekvensinformation enbart för att generera sekvensspecifika prober, kan den allmänt tillämpas på en brett spektrum av organismer och vävnadsprov 3. I själva verket har ett antal storskaliga ISH studier genomförts för att dokumentera genuttryck och RNA lokalisering dynamiken i olika modellorganismer, vilket har lett tilletablering av viktiga samhällets resurser 4-11. Medan en mängd sond märkning och strategier upptäckt har utvecklats under åren, den kombinerade användningen av fluorescensmärkta detektionsreagens och enzymatiska signal steg förstärkning erbjuder betydande förbättringar i känslighet och upplösning av förfarandet 12. Här beskriver vi en optimerad fluorescent in situ hybridisering metod (FISH) använder tyramid signalförstärkning (TSA) för att visualisera RNA-uttryck och dynamik lokalisering i iscensatta Drosophila embryon. Förfarandet utförs i 96-brunnars PCR-platta format, vilket avsevärt underlättar samtidig bearbetning av ett stort antal prover.

När genomförts framgångsrikt, erbjuder detta förfarande en påfallande ökad detaljnivå i tid och rum analys av genuttryck och mRNA dynamik lokalisering under början Drosophila embryogenes. Faktiskt, såsom visas i fig 3A för den klassiska par-regeln genen Runt (kör), kan man använda detta protokoll att observera händelser genuttryck genom detektion av begynnande transkript foci i grupper om uttrycka kärnor. Dessutom, såsom visas i embryot mosaik i fig. 3B,...

Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos at JoVE.com

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Här beskriver vi en hel-mount lysrör<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH) protokoll för att bestämma uttrycket och lokalisering egenskaper RNA uttrycks under embryogenes i bananfluga,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

Hel Mount RNA Lysrör<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering av<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryon

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Research

JoVE Journal

Biology

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Dubbel Hela Montera in situ hybridisering för tidig kycklingembryon

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafisk Hela Mount högupplöst Dubbel Fluorescerande In Situ Hybridisering

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Använda Hela Mount På plats Hybridisering till Link Molekyl-och organismbiologi

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Hela berget<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering av E8.5 till E11.5 musembryon

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Detektering av viralt RNA genom Fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Analys av encelliga gentranskription av RNA-lysrör<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Kromosom Replikera Timing kombination med fluorescerande<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering i hela Mount Embryon och Cell Histologi Anpassad för marina Elasmobranchii

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

Hög upplösning Hela Mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering inom Zebrafish embryon för att studera genuttryck och funktion

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Analys av apoptos i Zebrafish embryon genom Hela montering Immunofluorescence att upptäcka Aktiverad Caspas 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...