Name: efficient chromatin immunoprecipitation using limiting amounts of biomass
Uploaded: 2013-05-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass at JoVE.com

この作品は、NIHの助成金CA141009とGM39067によってサポートされていました。私たちは、書かれた部分にコメントをE.パーネルとR. Yarringtonに感謝します。

1。マウス脾臓ナイーブCD4 T細胞の分離<ol><li>インスティテューショナルアニマルケアと利用委員会（IACUC）プロトコルと一致して人道的な方法でマウスを生け贄に捧げる。脾臓を分析し、10％FBSを含むDMEMを10ml含むペトリ皿に入れてください。 </li><li>脾細胞を解放するために2つのスライドガラスのフロスト端部を用いて脾臓をつぶす。 15ミリリットルコニカルチューブに細胞懸濁液を移す。...

<ol>
	<li>Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+chromatin+immunoprecipitation+to+clone+novel+E2F+target+promoters.">Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters.</a> Molecular and Cellular Biology. 21, 6820-6832 (2001).</li><li>Weinmann, A. S., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+unknown+target+genes+of+human+transcription+factors+using+chromatin+immunoprecipitation.">Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation.</a> Methods. 26, 37-47 (2002).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+nuclear+localization+of+NFAT+in+Foxp3++regulatory+T+cells+independent+of+calcineurin+activity.">Constitutive nuclear localization of NFAT in Foxp3+ regulatory T cells independent of calcineurin activity.</a> J. Immunol. 188, 4268-4277 (2012).</li><li>Shakya, A., Kang, J., Chumley, J., Williams, M. A., Tantin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oct1+is+a+switchable,+bipotential+stabilizer+of+repressed+and+inducible+transcriptional+states.">Oct1 is a switchable, bipotential stabilizer of repressed and inducible transcriptional states.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 450-459 (2011).</li><li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+(microChIP).">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP).</a> Nature Protocols. 3, 1032-1045 (2008).</li><li>Lubelsky, Y., Macalpine, H. K., Macalpine, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+localization+of+replication+factors.">Genome-wide localization of replication factors.</a> Methods. 57, 187-195 (2012).</li><li>O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+characterization+of+the+early+embryo+with+a+chromatin+immunoprecipitation+protocol+applicable+to+small+cell+populations.">Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations.</a> Nature Genetics. 38, 835-841 (2006).</li><li>Sikes, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+method+for+rapid+and+sensitive+chromatin+immunoprecipitation.">A streamlined method for rapid and sensitive chromatin immunoprecipitation.</a> Journal of Immunological Methods. 344, 58-63 (2009).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution.">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147, 1408-1419 (2011).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+structure+and+organization+of+eukaryotic+pre-initiation+complexes.">Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes.</a> Nature. 483, 295-301 (2012).</li><li>Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+ChIP-seq+experiments+for+DNA-binding+proteins.">Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins.</a> Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing.">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4, 651-657 (2007).</li></ol>

上記プロトコルが正確にチップを用いた主要リンパ球からDNAの濃縮を定量化する堅牢な方法を提供します。このプロトコルで堅牢性のために一つの大きな理由は、生物学的には複製が含まれていることです。上記のプロトコルは3が、独立して計算される濃縮を複製し使用しています。出力は、変動性の尺度を提供するために、計算された濃縮および標準偏差の程度を提供するために平均化さ...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Formaldehyde</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F-8775</td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate Buffered Saline</td>
 <td>Hyclone</td>
 <td>SH30256.01</td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease Inhibitor tablets</td>
 <td>Roche</td>
 <td>04693116001</td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein G magnetic beads</td>
 <td>Active Motif</td>
 <td>101945</td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase A (20 mg/ml)</td>
 <td>EMD Millipore</td>
 <td>556746</td>
 <td>Store at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Proteinase K (20 mg/ml)</td>
 <td>Roche</td>
 <td>03115879001</td>
 <td>Dissolve in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Platinum Taq DNA Polymerase</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>10966-034</td>
 <td>Store at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SYBR Green I</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>S7567</td>
 <td>Store at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M Glycine</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO3)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Prepare fresh</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 M NaCl</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.5 M EDTA</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M Tris-HCl, pH 6.5</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table of Specific Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clay Adams Brand Nutator</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>Model: 421105</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnetic Stand</td>
 <td>Promega</td>
 <td>Z5342</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Qiaquick PCR Purification Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Masonix Sonicator 3000</td>
 <td>QSonica</td>
 <td>Model: S3000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UV Spectrophotometer</td>
 <td>NanoDrop Technologies</td>
 <td>ND-1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heating Block</td>
 <td>VWR</td>
 <td>13259-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotator</td>
 <td>VWR</td>
 <td>80085-692 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Refrigerated bench top centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Model: Allegra X-12R</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcentrifuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5415 D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table of Equipment </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

efficient chromatin immunoprecipitation using limiting amounts of biomass

クロマチン免疫沈降（チップ）は、生きた細胞のクロマチン中のDNAと異なるタンパク質との相互作用を決定するために広く用いられている方法である。例としては、配列特異的DNA結合転写因子、ヒストンおよびそれらの異なる変形状態が、そのようなRNAポリメラーゼおよび補助因子として酵素およびDNA修復成分を含む。その普遍性にもかかわらず、最新の欠如、相互作用の定量的な評価指標を可能材のベンチの準備の両方の正確な分析のための詳細な方法論があります。この情報の欠如に起因し、また、任意の免疫沈降のように、条件は実験条件の新しいセットの再最適化する必要があり、あるため、ChIP解析が不正確又は不十分な定量結果を受けやすい。 我々のプロトコルは、最終的に転写因子で精液の仕事に由来する：DNA相互作用1,2が、感作に多くの改良を組み込ん困難な得る細胞タイプに対するVITY及び再現。プロトコルは、DNAの濃縮を定量する定量PCRを用いて、以下のプロトコルの半定量的変異体を使用して両方が正常3,4使用されている。 PCR増幅された材料のこの定量的な分析は、計算行い、アッセイにおける制限因子を表す。重要なコントロールやその他の考慮事項は、下に変更を表示しないようにこのような研究対象のタンパク質（または予想に拘束されることにしないと予測遺伝子間領域としてアイソタイプをマッチさせた抗体の使用だけでなく、ゲノムDNAの制御領域の評価を含んで実験条件）。さらに、すべてのChIPのサンプルの入力材料の標準曲線を実験材料で濃縮度の絶対レベルを導出するために使用される。標準曲線の使用は関係なく設計されているどのように慎重にの、プライマーセット間のアカウントの違いを考慮するのに役立ち、また、効率が異なる単一プライマーセット用のテンプレート濃度の範囲全体にわたってences。我々のプロトコルは、我々は広範囲に後で、分析フェーズをカバーするという点で5-8利用可能な他のものとは異なっている。

もしあればクロマチン免疫沈降（ChIPの）プロトコルは、このように &quot;ローディングコントロール&quot;として、ゲノムの非結合領域を増幅するプライマー対を使用してPCRで使用されるDNAの量で、相違のためにここコントロールを提示した。 図3に示す例では、標的領域としてマウスIL2プロモーターの利息および転写因子NFAT結合部位の我々のタンパク質に結合していない領...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass at JoVE.com

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

我々は、一次T細胞を用いたクロマチン免疫沈降のための堅牢な方法が記載されている。メソッドは、標準的なアプローチの上に成り立ったが、細胞の数量限定のために効率を改善条件や試薬の特定のセットを使用しています。重要なことは、データ分析段階の詳細な説明が提示される。

バイオマスの制限額を使用して効率的なクロマチン免疫沈降

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

ヒト胚性幹細胞からクロマチン免疫沈降

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

生物学

Methylated DNA Immunoprecipitation

メチル化DNA免疫沈降

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

ヒト細胞において活性化遺伝子発現のアッセイのダイナミックヒストン修飾のクロマチン免疫沈降（ChIP）

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

初期段階のマウス胚を用いて組織特異的遺伝子のためのクロマチン免疫沈降アッセイ

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

同系ゼブラフィッシュにおける限界希釈細胞移植を用いた腫瘍増殖細胞の頻度を定量化

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

を使用してクロマチン免疫沈降（ChIP）ショウジョウバエ組織

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

ハイスループットシーケンシングのための高品質クロマチン免疫沈降DNAテンプレート（チップ-SEQ）の生成

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

ホールマウント胚珠内でのクロマチン修飾や核構造の定量的、単一細胞分析のための効率的な方法<em&gt;シロイヌナズナ</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

SILAC免疫沈降定量的プロテオミクスを用いて哺乳動物細胞におけるタンパク質相互作用パートナーの同定

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

シロイヌナズナタンパク質-DNA相互作用の同定のための免疫沈降アッセイクロマチン<em&gt;インビボ</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...