Name: isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle
Uploaded: 2013-03-22T12:00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle at JoVE.com

Vi vil gerne takke Sarah Dick for at yde kritisk læsning og kommentarer. MAR holder Canada Research Chair i Molekylær Genetik og er en International Research Scholar af Howard Hughes Medical Institute. Dette arbejde blev støttet af tilskud til MAR fra National Institutes of Health, Howard Hughes Medical Institute, den canadiske Institutes of Health Research, den Muskelsvindfonden Association og Canada Research Chair Program.

Alle forsøg blev håndteret ifølge University of Ottawa regler for pasning af dyr og håndtering. Se Tabel 1 for en oversigt over protokollen. 1. Før du starter Isolation <ol><li> Forbered følgende løsninger: 0,2% Kollagenase type I i DMEM (Dulbeccos modificerede Eagles medium, high glucose, L-glutamin med 110 mg / ml natriumpyruvat). For to EDL muskler fremstilling af 2 ml 0,2% Collagenease i DMEM. Opløsningen filtreres gennem 0,22 um filter. 10 min før isolation, forvarm ved 37 ° C i et vandbad. Yderligere portioner af ufortyndet collagenase kan fryses ved -20 ° C til senere brug. Bemærk: Anvend DMEM med natriumpyruvat gennem hele proceduren. Fibre ikke overleve i natriumpyruvat-frit medium. <ul><li> Vaske medier (bruge til at udføre alle de vaske). Supplement DMEM med 1% penicillin / streptomycin. Filtreres gennem 00,22 um filter før brug. </li><li> Myofiber dyrkningsmedier. Supplere DMEM med 20% FBS, 1% Chicken Embryo ekstrakt og 1% penicillin / streptomycin. Der filtreres gennem 0,22 um filter før brug. </li><li> Matrigel overtrukne skåle. Til kultur fibre til længere tid, anbefaler vi at bruge Matrigel som coating substrat. Til fremstilling Matrigel coatede skåle, tø en alikvot af Matrigel ved 4 ° C natten over. Dagen efter, fortynde Matrigel 1:10 i DMEM. Hold Matrigel ved 4 ° C hele tiden og undgå pludselige temperaturændringer, da dette vil skabe mikroskopiske krystaller i Matrigel opløsning bliver ujævn coating. Sted retter skal coates på is. Coat retter med lige nok volumen til at dække overfladen. Lad det sidde i 1 min. Helt fjerne sidesten Matrigel. Lad retter tørre ved 37 ° C i mindst 3 timer før brug eller natten over. </li></ul> Bemærk: alikvoter af fortyndet Matrigel kan genbruges flere gange til overtrækning formål, hvis opbevaret ved 4 &amp; deg; C. </li><li> Endelig skal du sørge for at rense mikroskop station og dissekere værktøjer med 70% ethanol. </li><li> For to EDL isolationer (en mus) fremstilles fem plast petriskåle (60 * 15mm) som følger: <ul><li> Fire retter til isolering (1 for muskel dissociation, 3 for serielle vaske). Alle retter skal overtrækkes med hesteserum (HS) for at forhindre myofibre fra knyttet til plast. At overtrække, at pipette 3 ml hesteserum i hver skål, hvirvel sikre jævn belægning, fjernes hesteserum og lad skålen tørre i mindst 30 min. Tilsæt 4 ml DMEM til hver skål. Holde retter ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator før anvendelse. </li></ul> Bemærk: Horse serum kan genbruges flere gange, hvis den opbevares sterilt. Alternativt kan en opløsning af 10% HS i DMEM anvendes til at coate retter. Brug HS coatede retter hele protokol og når dyrkning myofibre på flydende vilkår. <ul><li> En skål vil blive anvendt til dyrkning myofibre efter isolering. Alternative dish størrelser eller formater kan anvendes til den endelige dyrkning af myofibre afhængigt efterfølgende anvendelser. Men vi ikke foreslå parabol størrelser større end 60 * 15mm. Myofibre kan holdes i suspension i længere tid end 96 timer før hyper sammentrækning opstår. For længere kultur gange, anbefaler vi at bruge Matrigel coatede fade eller tallerkener. </li></ul></li><li> For én fiber isolation (2 EDL), udarbejde to sterile Pasteur-pipetter: en stor boring pipette til muskel håndtering og en lille boring pipette til myofiber manipulation. Brug en diamant pen til at skære hver glaspipette til den ønskede længde og varme polish til at udjævne pipette kanter. Ved hjælp af flammen,. Kurve spidsen af ​​den lille boring pipette Dette vil hjælpe håndtering enkelte fibre. Flame at sterilisere. Coat hver pipette med HS før brug. </li></ol> 2. Muskel Dissection og fordøjelse <ol><li> Med henblik på disse eksperimenter, 8 uger gamle SV129, Pax7 créer Cklr; Rosa26TdTomato (Pax7Cre-TdTomato) og Myf5-Cre, Rosa26YFP blev anvendt. </li><li> Spray bagben med 70% ethanol. Pin dyret (opad) til en støttegruppe bord for at få en bedre forståelse af bagbenet under proceduren. </li><li> Ved hjælp af en saks, skære igennem hele længden af ​​benet og blotlægge den underliggende muskel. Fjerne huden samt enhver hår eller pels (figur 1A). </li><li> Med en fin saks, skære igennem den tynde fascia uden at beskadige de underliggende muskler. Visuelt lokalisere EDL. EDL findes i den forreste rum af bagbenet lige under tibialis anterior (TA) muskel. </li><li> Med hjælp af to pincet, udsætter de distale sener. </li><li> Skær de distale sener (af både TA og EDL) med skarpe Cohann-Vannas foråret saks. </li><li> Ved hjælp af pincet holde både TA og EDL muskler fra deres sener og fint trækker musklerne sig mod den proximale ende. På dette tidspunkt bør du være i stand til klart at seEDL muskel lige under TA musklen. Nu adskille EDL fra TA musklen ved at trække de to sener i modsatte retninger (figur 1B). Undgå at strække EDL muskler, mens de udfører denne handling, da dette vil beskadige myofibre. </li><li> Udsætte EDL senen. For bedre at visualisere den proximale senen det kan hjælpe på dette tidspunkt for at fjerne TA musklen. Det kan også hjælpe til at afskære nogle bindevævet omkring knæet (figur 1C). </li><li> Skær den proksimale senen og fjern forsigtigt EDL (Figur 1D). </li><li> Ved at holde musklerne gennem sener, overføres til 2 ml af tidligere fremstillet collagenase opløsning. Inkuber ved 37 ° C i et vandbad. Bemærk: for vellykket fiber isolation, er det vigtigt at isolere EDL fra senen til senen, således at myofiber integritet bevares. Trin fra 2,3 til 2,9 kan udføres under et dissektionsmikroskop. Alternativt kan anvendelsen af ​​en magnifying glas kan også bidrage til at få en bedre visning af musklerne. </li><li> Gentag trin fra 2,3 til 2,9 for at isolere den anden EDL. Overfør det andet EDL i det samme rør. For at undgå ujævn spaltning, bør isolering af den anden EDL være afsluttet mere end 5 min efter den første. Note 1: inkubationstid kan være nødvendigt at justere afhængigt af collagenaseaktivitet. Kortere eller længere inkubation kan være nødvendig afhængig af størrelse, alder og / eller muskel tilstand (f.eks fibrotiske muskler har brug for længere fordøjelse tid). Note 2: Hvis behandlingen satellit celler opførsel under hvile betingelser, agitation under muskel fordøjelse tid kan aktivere satellit celler 10. </li><li> Under fordøjelsen tid, regelmæssigt kontrollere musklen til at undgå over-fordøjelse. Stop fordøjelse, når musklerne begynder at løsne op og myofibre er synlige. For at stoppe fordøjelsen, omhyggeligt overføre begge muskler til en forvarmet petriskål med 4 ml DMEM (dissociatipå fad). Brug den store boring størrelse pipette til at udføre denne operation. Bemærk: undgå muskel overdigestion som dette medfører uvægerligt isolering af hyper indgået myofibre. </li></ol> 3. Single Myofiber Dissociation og Kultur <ol><li> For at udløse myofibre, bruges den store boring glaspipette at skylle musklen med varmt medium, indtil fibrene naturligt begynder at blive frigivet. Må ikke udriv musklen, da dette uundgåeligt vil resultere i skadelige fibre. Udfør denne og de følgende trin under et dissektionsmikroskop. </li><li> Fortsæt frigive myofibre indtil det ønskede antal er nået. Hvis skålen er påkrævet ved stuetemperatur i mere end 10 min tillader en 5 min (minimum) inkubation ved 37 ° C, 5% CO2 at re-ækvilibrering mediet. Bemærk: Hvis mediet når temperaturer under fysiologiske (37 ° C) i længere tid myofibre vil dø. </li><li> Brug den lille størrelse boring pipette, transfer lever enlige myofibre til en ny forvarmet skål (første af tre på hinanden følgende gange vask). Håndtere hver myofiber individuelt i stedet for at overføre størstedelen af ​​myofibre på én gang. Om nødvendigt, inkuber ved 37 ° C, 5% CO2 i 10-15 minutter for at re-ækvilibrering mediet. </li><li> Gentag trin 3,3 til 2 gange mere, eller indtil alle døde myofibre og snavs fjernes. Vi anbefaler mindst tre på hinanden følgende vaske til korrekt oprydning. Bemærk: dead myofibre vises som kort og hyper indgået under mikroskop lys. </li><li> Inkuber enkelt myofibre ved 37 ° C, 5% CO2 i den sidste vask skålen (DMEM alene) i mindst en time før skift til dyrkningsmediet. Dette gør det muligt myofibre at tilpasse sig den in vitro-betingelser i fravær af serum. Vi fandt, at øjeblikkelig kultur myofibre i serum rigt medium øger fiber krympning. </li><li> Efter én time, overfører myofibre i et nyt forvarmet skål eller til den passende kultur formatetafhængigt af den efterfølgende anvendelse. Kultur fibre i høj serummedium for at tillade satellit celleaktivering. Alternativt kan forskellige koncentrationer af serum eller kyllingefoster ekstrakt også anvendes. Skift medium hver anden dag. </li></ol> 4. Downstream Applications <ol><li> Immunfarvning. Levende myofibre kan fikseres og farves på noget tidspunkt under isoleringen. Immunofluorescens kan udføres på både flydende og substrat-fastgjort myofibre. Hvis farvning flydende myofibre, bruge en lille boring glas pipette til at overføre myofibre fra én løsning til en anden. Alternativt er det muligt at holde myofibre i den samme brønd i hele proceduren og tilføje / fjerne opløsninger under anvendelse af en glaspipette. Undgå standard aspiration da dette vil resultere i fjernelse af de myofibre og. Kort beskrevet helt fjerne dyrkningsmediet, fix myofibre i forvarmet 4% paraformaldehyd (PFA) i 5 min. Ekstensivt vaskes i PBS flere gange. Incubate myofibre i 1% glycin i PBS eller andre standard quenching løsninger til at minimere PFA baggrundsfarvning. Om nødvendigt permeabilisere myofibre med 0,1% Triton X-100 i PBS i 10 minutter efterfulgt af en 5 min vask i PBS. Inkuber fibre i blokeringsopløsning (10% hesteserum, 0,1% Triton X-100, 1% NaN) i 1 time ved stuetemperatur eller fortrinsvis natten over ved 4 ° C. Alternative blokerende opløsninger kan anvendes, afhængig af antistof af interesse. Vask én gang i PBS i 5 min. Inkuberes med det passende primære antistof fortyndet i blokeringsopløsning i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C. Vask fibre 3 gange med 5 min per vask i PBS til fjernelse af eventuelt ubundet antistof. Inkuberes med det passende sekundære antistof i 45 minutter til 1 time ved stuetemperatur. Vask 3 gange med 5 min per vask i PBS. Kontrastfarve kerner med 1 mg / ml DAPI. Hvis farvning flydende fibre, overfører hver fiber til et objektglas er egnet til mikroskopi. Fjern eventuelle overskud af PBS eller medium. Anvend montering medium og derefter tilføje dækglas. Fortsæt til visualisere myofibre under et fluorescensmikroskop. Se figur 4 for repræsentative immunofluorescens på EDL myofibre. Alternative farvningsprocedurer med stærkere fikseringsmidler er beskrevet i Verma, M. et al. 11 og Wosniak, AC et al. Tolv. </li><li> Oligonukleotid eller plasmid forbigående transfektion. Levende myofibre kan transficeres med plasmid eller siRNA for specifikke gen / s af interesse. Når du bruger siRNA, er dobbelt transfektion anbefales til effektiv gen knockdown. Vi foreslår at udføre den første transfektion efter 8 timer fra isolation. Seks timer efter transfektion, udskiftes med frisk medium. For siRNA transfektion, foreslår vi starter ved hjælp af en slutkoncentration på 50 nM. Genekspression knockdown kan analyseres ved RNA-ekstraktion eller fortrinsvis ved immunfarvning. </li><li> Virusinfektion. Infektion af levende myofibre er muligt selv om forekomsten af ​​cellendøden er højere end med oligo transfektion og effektiviteten af ​​infektion kan være variabel afhængig af muskel forhold og alder. For eksempel, er intakte voksne muskel myofibre især ikke reagerer på virusinfektion grund af tilstedeværelsen af den basale lamina, som har vist sig at tilvejebringe en beskyttende barriere mod vært-infektion 13, 14. Lentivirusvektorer foretrækkes frem for retrovirale vektorer, da de kan inficere hvilende (ikke mitotiske) celler. For viral infektion, er det tilrådeligt at kultur fibre på en Matrigel coated skål eller plade og lade myofibre tilpasse sig alle betingelser for de første 24 timer. </li><li> Levende Imaging. Direkte billedvisning af myofibre er særligt tidskrævende og nødvendiggør et mikroskop udstyret med et 37 ° C, 5% CO2 kammer. Det er nyttigt ved vurderingen af ​​adfærd enkelt satellit celler. Arbejde udført under anvendelse af denne teknik har været medvirkende til opdagelsen af ​​satellitcelle heterogenitet og at studere deres adfærdsvior på fibre (15 og 16). </li></ol>

<ol>
	<li>Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+muscle+satellite+cells+on+intact+myofibers+in+culture.">Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibers in culture.</a> Dev. Biol. 115 (1), 129-139 (1986).</li><li>Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+satellite+cells+from+living+single+muscle+fiber+explants.">Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 31 (10), 773-779 (1995).</li><li>Anderson, J. E., Wozniak, A. C., Misunoya, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+muscle+fiber+isolation+and+culture+for+cellular+molecular,+pharmacological,+and+evolutionary+studies.">Single muscle fiber isolation and culture for cellular molecular, pharmacological, and evolutionary studies.</a> Methods Mol. Biol. 798, 85-102 (2012).</li><li>Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+skeletal+muscle+myofibers+as+a+means+to+analyze+satellite+cells.">Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells.</a> Methods Mol. Biol. 290, 281-304 (2005).</li><li>White, R. B., Bi&#233;rinx, A. S., Gnocchi, V. F., Zammit, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+muscle+fibre+growth+during+postnatal+mouse+development.">Dynamics of muscle fibre growth during postnatal mouse development.</a> BMC Developmental Biology. 10 (21), 1-11 (2010).</li><li>Siegel, A. L., Kuhlmann, P. K., Cornelison, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+satellite+cell+proliferation+and+association:+new+insights+from+myofiber+time-lapse+imaging.">Muscle satellite cell proliferation and association: new insights from myofiber time-lapse imaging.</a> Skeletal Muscle. 2 (1), 1-7 (2011).</li><li>Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+muscle+stem+cells+by+fluorescence+activated+cell+sorting+cytometry.">Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 798, 53-64 (2012).</li><li>Engler, A. D., Griffin, M. A., Sen, S., Bonnemann, C. G., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotubes+differentiate+optimally+on+substrates+with+tissue-like+stiffness:+pathological+implications+for+soft+or+stiff+microenvironments.">Myotubes differentiate optimally on substrates with tissue-like stiffness: pathological implications for soft or stiff microenvironments.</a> J. Cell. Biol. 166 (4), 877-887 (2004).</li><li>Boonen, K. J., Post, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+muscle+stem+cell+niche:+regulation+of+satellite+cells+during+regeneration.">The muscle stem cell niche: regulation of satellite cells during regeneration.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 14 (4), 419-431 (2008).</li><li>Wozniak, A. C., Anderson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-fiber+isolation+and+maintenance+of+satellite+cell+quiescence.">Single-fiber isolation and maintenance of satellite cell quiescence.</a> Biochem. Cell Biol. 83 (5), 674-676 (2005).</li><li>Verma, M., Asukura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Single+Muscle+Fiber+Isolation+from+Alcohol-Fixed+Adult+Muscle+following+&#946;-Galactosidase+Staining+for+Satellite+Cell+Detection.">Efficient Single Muscle Fiber Isolation from Alcohol-Fixed Adult Muscle following &#946;-Galactosidase Staining for Satellite Cell Detection.</a> J. Histochem. Cytochem. 59 (1), 60-67 (2001).</li><li>Wosniak, A. C., Pilipowics, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-Met+expression+and+mechanical+activation+of+satellite+cells+on+cultured+muscle+fibers.">C-Met expression and mechanical activation of satellite cells on cultured muscle fibers.</a> J. Histochem. Cytochem. 51 (11), 1437-1445 (2003).</li><li>Huard, J., Feero, W. G., Watkin, S. C., Hoffman, E. P., Rosenblatt, J. D., Glorioso, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basal+lamina+is+a+physical+barrier+to+herpes+simplex+virus-mediated+gene+delivery+to+mature+muscle+fibers.">The basal lamina is a physical barrier to herpes simplex virus-mediated gene delivery to mature muscle fibers.</a> J. Virol. 70 (11), 8117-8123 (1996).</li><li>Feero, W. G., Rosenblatt, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+gene+delivery+to+skeletal+muscle:+insights+on+maturation-dependent+loss+of+fiber+infectivity+for+adenovirus+and+herpes+simplex+type+1+viral+vectors.">Viral gene delivery to skeletal muscle: insights on maturation-dependent loss of fiber infectivity for adenovirus and herpes simplex type 1 viral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 8 (4), 371-380 (1997).</li><li>Kuang, S., Kuroda, K., grand, F. L. e., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+self-renewal+and+commitment+of+satellite+stem+cells+in+muscle.">Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle.</a> Cell. 129 (5), 999-1010 (2007).</li><li>Siegel, A. L., Atchison, K., Fisher, K. E., Davis, G. E., Cornelison, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+timelapse+analysis+of+muscle+satellite+cell+motility.">3D timelapse analysis of muscle satellite cell motility.</a> Stem Cells. 27 (10), 2527-2538 (2009).</li><li>Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax7+is+required+for+the+specification+of+myogenic+satellite+cells.">Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells.</a> Cell. 102 (6), 777-786 (2000).</li><li>Zammit, P., Golding, J. P., Nagata, Y., Hudon, V., Partridge, T. A., Beauchamp, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+satellite+cells+adopt+divergent+fates:+a+mechanism+for+self-renewal.">Muscle satellite cells adopt divergent fates: a mechanism for self-renewal.</a> J. Cell Biol. 166 (3), 347-357 (2004).</li></ol>

Ingen konkurrerende interesser.

The isolering og dyrkning af enkelte myofibre fra intakte muskler giver en fremragende in vitro-model til at undersøge fremgangsmåden ifølge muskelregenerationen. En unik egenskab ved dette system er bevarelsen af ​​satellitceller i deres fysiologiske miljø under basale lamina. Vigtigst kan teknikken benyttes til at undersøge muskel stamceller adfærd i både hviletilstand og aktiverede tilstande. Gennem de sidste 20 år har myofiber dyrkningssystemet billede meningsfulde indsigt i biologi satellitcelle population med hensyn til både indre og ydre faktorer. Ved dyrkning af individuelle myofibre, er satellitcelle heterogenitet med hensyn til myofiber, muskel type eller regenerationsevne blevet behandlet 15. Udarbejde studier med levende billeder af enkelte dyrkede fibre tilladt for den modtagende information om satellit cellemigration mønster 16. Købet af kvantitative data er etLSO muligt. Selvom tidskrævende, giver det væsentlige oplysninger om fordelingen og indtræden af ​​bestemte hændelser (stamceller asymmetrisk division, proliferation og differentiering forhold osv.). Sammen med tidligere beskrevne anvendelser, protein eller RNA-ekstraktion fra enkelte fibre er også muligt, selv om isolering af ren population af satellit-celler ved FACS eller andre midler kan tilvejebringe et bedre grundlag til at undersøge protein-eller genekspression ændringer på molekylært niveau. Det er vores erfaring, er det mest kritiske skridt for en vellykket fiber isolering af &quot;sene til senen&quot; isolation (trin fra 2,5 til 2,9 i protokollen tekst). Dette garanterer, at efter muskel fordøjelse, er fibre frigøres fra EDL med minimal eller ingen skade og dermed øge deres præstationer i de følgende trin.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens / Material </td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C0130-1g </td><td> Forbered friske alle tidspunkter for at opnå optimale resultater. Yderligere portioner af ufortyndet collagenase kan opbevares ved -20 ° C. </td></tr><tr><td> DMEM High Glucose + NaPyr </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td> Tilsætning af Pen / Strep nødvendigt at minimere luft forureninger </td></tr><tr><td> Kendetegnet føtalt bovint serum </td><td> Hyclone </td><td> SH30396.03 </td><td> Lot # KUJ35152 </td></tr><tr><td> Hesteserum </td><td> Hyclone </td><td> SH300.74.03 </td><td> Lot # AVJ82494 </td></tr><tr><td> Chicken Embryo Extract </td><td> Accurate Chemical </td><td> CE-650-T, Batch B7035010 </td><td> Undgå frysning-optøning cyklusser. </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD </td><td></td><td> Opbevar portioner ved -20 ° C. Undgå frysning-optøning cyklusser. Opbevares fortyndede alikvoter ved 4 ° C. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Udstyr </td></tr><tr><td> Cohann-Vannas Spring Scissor 6mm Blades-Straight-Sharp </td><td> Fin Science Tools </td><td> 15.000-02 </td><td></td></tr><tr><td> Ekstra Thin Iris Sakse-10.5cm </td><td> Fin Science Tools </td><td> 14.088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Moria-Iris Tang Kurvet </td><td> Fin Science Tools </td><td> 11.373-12 </td><td></td></tr><tr><td> Pasteurpipetter </td><td> VWR </td><td> 14672-380 </td><td> 14672-200 </td></tr><tr><td> Diamond Pen </td><td> VWR </td><td> 52865-005 </td><td></td></tr><tr><td> 60 * 15mm petriskål </td><td> VWR </td><td> 25384-092 </td><td></td></tr><tr><td> Acrodisc 0,22 um filter </td&gt; <td> VWR </td><td> CA28-145-477 </td><td></td></tr><tr><td> Dissektionsmikroskop StemiV6 </td><td> Zeiss </td><td></td><td> En yderligere lyskilde kan være forpligtet til at have et bedre fokus visning </td></tr></tbody></table>

isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle

Muskelregenerationen i den voksne udføres af hjemmehørende stamceller kaldet satellit celler. Satellitceller er defineret ved deres position mellem den basale lamina og sarcolemma af hver myofiber. Aktuelle viden om deres adfærd er stærkt afhængig af brugen af ​​den fælles myofiber isolation protokol. I 1985 beskrev Bischoff en protokol til at isolere enkelte levende fibre fra flexor digitorum brevis (FDB) af voksne rotter med det formål at skabe et in vitro system, hvori den fysiske forbindelse mellem myofiber og dens stamceller bevares 1. I 1995 Rosenblattmodified den Bischoff-protokollen således at myofibre er enkeltvis plukkes og håndteres adskilt efter collagenasefordøjelse stedet for at blive isoleret ved gravitationssedimentation 2, 3. Den Rosenblatt eller Bischoff protokol er siden blevet tilpasset forskellige muskler, alder eller betingelser 3-6. Den enkelte myofiber isolation teknik er et uundværligtværktøj på grund af dens unikke fordele. Dels i det indre myofiber protokollen, er satellit-celler opretholdt under basale lamina. Dette er en unik funktion i protokollen som andre teknikker, såsom fluorescensaktiveret cellesortering kræver kemisk og mekanisk væv dissociation 7. Selvom myofiber kultur-systemet ikke kan erstatte in vivo-undersøgelser, betyder det tilbyde en fremragende platform til at løse relevante biologiske egenskaber af muskel stamceller. Single myofibre kan dyrkes i standard plating forhold eller i flydende betingelser. Satellitceller på flydende myofibre udsættes for praktisk talt ingen yderligere indflydelse end myofiber miljø. Substrat stivhed og overtræk har vist sig at påvirke satellit cellers evne til at regenerere muskler 8, 9, således at kunne styre hver af disse faktorer uafhængigt tillader diskriminering mellem niche-afhængige og-uafhængige reaktioner. Forskellige koncentrationer af serum harogså vist sig at have en virkning på overgangen fra hviletilstand til aktivering. For at bevare quiescence tilstand af de tilknyttede satellitceller, bør fibrene opbevares i lavt serum-medium 1-3. Dette er særligt nyttigt, når studere gener involveret i hvile tilstand. I serum rigt medium, satellit celler hurtigt aktivere, formere sig, migrere og differentiere, hvilket efterligner in vivo regenerative proces 1-3. Systemet kan anvendes til at udføre en række assays, såsom undersøgelse af kemiske inhibitorer, ektopisk ekspression af gener af virus levering, oligonucleotid baseret Knock-down eller direkte billedvisning. Videoen artikel beskriver protokollen for tiden anvendes i vores laboratorium at isolere enkelte myofibre fra extensor digitorum Longus (EDL) muskel i voksne mus (6-8 uger gamle).

Her beskrev vi isoleringen af ​​de enkelte myofibre fra EDL muskel af voksne mus. Succesfulde myofibre udbytte afhænger af flere faktorer, såsom collagenase aktivitet eller muskel betingelser eller alder. Det vigtigste er, at isolation af musklen fra senen til sene resulterer i lange, intakte myofibre fra EDL muskler. Figur 1 viser en trinvis grafisk afbildning af &quot;sene til senen&quot; isolation. Når musklen fuldstændigt fordøjes, er myofibre frigøres ved at påføre let tryk på musklen. Figur 2A viser et repræsentativt billede af en myofiber isolation eksperiment efter den første vask. På dette tidspunkt kulturen indeholder en blanding af bundter af enkelte myofibre som fremkommer som lange og skinnende rørformede strukturer, hyper kontrakt myofibre, som er mørke og korte og snavs fra udrådningsprocessen. Ved udgangen af ​​mindst tre på hinanden følgende skylninger, bør kun enkelte levende myofibre forblive i dish til kultur eller nedstrøms analyse (figur 2B). Figur 2C viser et langt, levende fiber i forhold til en hyper kontraheret fiber (C &#39;). På tidspunktet for isolering, synes satellitceller som små fremspring på myofiber overflade (figur 3A). Hvis vedligeholdes i serum rigt medium, satellit celler aktivere, formere sig, migrere og i sidste ende smelte sammen til myorør (B). Efter 15 dage i kultur, udtrykke alle myorør den Myf5 reporter YFP (C) tyder på, at muskelregenerationen i den voksne udføres af celler, som på et tidspunkt i deres udvikling havde udtrykt den myogene afgørende faktor Myf5. Alle satellit celler udtrykker den parrede box transkriptionsfaktoren Pax7 17. Reporter muse line Pax7Cre-TdTomato kan anvendes til at spore satellitceller via ekspressionen af TdTomato fluorescenssignal (fig. 3D og E). Figur 4 viser et repræsentativt IMMUnofluorescence af dobbelt Pax7 + / MyoD satellitceller. Klassisk dobbelt Pax7 + / MyoD + satellit cellerne betragtes proliferative engagerede muskel stamceller, der enten vil fuldføre differentiering program ved nedregulering Pax7 samtidig opretholde MyoD udtryk eller vende tilbage til hviletilstand ved nedregulering MyoD og opretholdelse Pax7 udtryk 18 <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig1.jpg" alt="Figur 1"/> Figur 1. EDL muskel isolation fra mus bagben. A. Bagben af en 8 uger gamle voksne mus. Pile angiver den distale (knæ) senen og den proximale (fod) senen. B. Anatomisk position tibialis anterior (TA) muskel og det extensor digitorum Longus (EDL) muskel. C. Ved at holde EDL gennem den proximale senen, er musklen trækkes mod knæet for at blotlægge den distale senen. D. Den distale senen erklippe og EDL er frigivet. <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig2.jpg" alt="Figur 2"/> Figur 2. Repræsentative resultater af en enkelt myofiber isolation eksperiment. A. Bright felt billede af en myofiber isolation eksperiment ved det første vasketrin. Rød pil indikerer levende myofibre, hvid pil angiver hyper kontraherede myofibre og gul pil angiver celler, myofiber eller ECM vragrester. B. Efter hinanden følgende gange vask i DMEM, er der kun levende myofibre. C og C &#39;. Billedet repræsenterer en lang intakt levende myofiber (C) og en kort hyper kontraheret myofiber (C &#39;). Bar 10 um. Billederne blev taget med et Zeiss Axio Observer Z1 mikroskop udstyret med AxioCam HR. <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig3.jpg" alt="Figur 3"/> Figur<html> e 3. Repræsentative resultater af en enkelt myofiber kultur eksperiment. A. Bright felt billede af en enkelt, levende myofiber med tilhørende satellit celle (pil) lige efter isolation (Time 0). B. Single myofibre blev udpladet på Matrigel og dyrket i serum rigt medium i 15 dage. Hvid pil angiver differentierede myorør sammenlignet med enkelte celler (gul pil) C. Enkelte myofibre fra en Myf5Cre, RosaYFP mus blev dyrket som i B. Pilen angiver Myf5 afledte myorør. D og E. Enkelte myofibre fra Pax7Cre, TdTomato blev isoleret og fikseret lige efter. Pile angiver Pax7 positiv hvilende satellit celle (E, red). Kerner blev modfarvet med DAPI (D). Bar: 50 pm. Billederne blev taget med et Zeiss Axio Observer Z1 mikroskop udstyret med AxioCam HR. måder &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig4.jpg" alt="Figur 4"/> Figur 4. Eksempel på immunfluorescensfarvning af satellit celler på myofibre. Enkelte myofibre blev isoleret og dyrket i 72 timer i flydende betingelser. Satellitceller på myofibre blev farvet for satellitcelle specifik markør Pax7 (B, rød) og den myogene regulatorisk faktor MyoD (C, grøn). Kerner blev modfarvet med DAPI (A). Barer: 50 pm. Billederne blev taget med et Zeiss Axio Observer Z1 mikroskop udstyret med AxioCam HR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Muskel Dissection (5 min hver muskel) </td><td><ul><li> Senen til senen isolation </li><li> Skarpe værktøjer </li><li> Minimal muskelskade </li></ul></td></tr><tr><td> Muskel Digestion (30-45 min) </td><td><ul><li> Temperaturfølsom </li><li> Undgå overdigestion </li></ul></td></tr><tr><td> Fiber isolation </td><td><ul><li> Undgå over manipulation af fibre </li><li> Fjerne urenheder med adskillige vaske </li></ul></td></tr><tr><td> Fiber Culture (op til 3-4 uger) </td><td><ul><li> Format: enhver </li><li> Coating: hesteserum, Matrigel </li><li> Medium: basal eller høje serum </li></ul></td></tr></tbody></table> Tabel 1. Oversigt over myofiber isolation protokollen. Den myofiber isolation protokol består af 4 store skridt. For hvert trin, er den omtrentlige tid og store kritiske punkter drøftet. For detaljeret diskussion af hvert trin, henvises til protokollen tekst.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle at JoVE.com

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolering og kultur myofibre er guldstandarden<em&gt; In vitro</em&gt; System til at studere overgangen af ​​satellit celler gennem ro, aktivering og differentiering. Vigtigere er det, den enkelte myofiber kultur-system bevarer myofiber / stamcelle forening, som er en væsentlig bestanddel af muskel stamceller niche.

Isolering og dyrkning af individuelle myofibre og deres satellit celler fra voksne skeletmuskler

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Analyse af embryonale og larvestadiet Zebrafisk Skeletal myofibre fra Dissocierede Forberedelser

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Isolation, Kultur og transplantation af Muskel satellit celler

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolering af blod-fartøj-afledt Multipotente Forstadier fra human skeletmuskel

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolering og dyrkning af Dental Epiteliale stamceller fra voksne mus Fortand

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Elektroporation, Isolering og Imaging af -myofibre

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Isolering og kultur af primære muskeratinocytter fra neonatal og voksen mus hud

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Isolering og karakterisering af exosomer fra skeletmuskelfibroblaster

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...