Name: protein transfection of mouse lung
Uploaded: 2013-05-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Transfection of Mouse Lung at JoVE.com

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (7R01HL098528-03) ve FAMRI Klinik Yenilikçi Ödülü ile desteklenmiştir.

1. Protein Transfeksiyon Reaktif hazırlanması <ol><li> Kuru film içeren tüp metanol ya da kloroform içinde 250 ul ekleyerek Pro-Ject Reaktif çözülür. </li><li> En yüksek hızda 10-20 saniye girdap. </li><li> Ayrı bir mikrosantrifüj tüpü içine Pro-Ject reaktif Pipet 20 ul. </li><li> Oda sıcaklığında 6 saat arasında, en az bir laminar akış başlığı altında Pro-Ject Reaktif içeren mikrosantrifüj tüpleri yerleştirerek çözücü buharlaşır. Bu tamamen kuru olmalıdır. Alternatif olarak, va...

<ol>
	<li>Glasser, S. W., Korfhagen, T. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+models+for+study+of+pulmonary+development+and+disease.">Transgenic models for study of pulmonary development and disease.</a> Am. J. Physiol. 267, 489-497 (1994).</li><li>D'Armiento, J., Dalal, S. S., Okada, Y., Berg, R. A., Chada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagenase+expression+in+the+lungs+of+transgenic+mice+causes+pulmonary+emphysema.">Collagenase expression in the lungs of transgenic mice causes pulmonary emphysema.</a> Cell. 71, 955-961 (1992).</li><li>Foronjy, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+dismutase+expression+attenuates+cigarette+smoke-+or+elastase-generated+emphysema+in+mice.">Superoxide dismutase expression attenuates cigarette smoke- or elastase-generated emphysema in mice.</a> Am. J. Respir Crit. Care Med. 173, 623-631 (2006).</li><li>Foronjy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+divergent+roles+of+secreted+frizzled+related+protein-1+(SFRP1)+in+lung+morphogenesis+and+emphysema.">The divergent roles of secreted frizzled related protein-1 (SFRP1) in lung morphogenesis and emphysema.</a> Am. J. Pathol. 177, 598-607 (2010).</li><li>Costa, R. H., Kalinichenko, V. V., Lim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+in+mouse+lung+development+and+function.">Transcription factors in mouse lung development and function.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 280, 823-838 (2001).</li><li>Perl, A. K., Tichelaar, J. W., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+gene+expression+in+the+respiratory+epithelium+of+the+mouse.">Conditional gene expression in the respiratory epithelium of the mouse.</a> Transgenic Research. 11, 21-29 (2002).</li><li>Morimoto, M., Kopan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rtTA+toxicity+limits+the+usefulness+of+the+SP-C-rtTA+transgenic+mouse.">rtTA toxicity limits the usefulness of the SP-C-rtTA transgenic mouse.</a> Dev. Biol. 325, 171-178 (2009).</li><li>Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+targeted+viral+vectors+for+gene+therapy.">Engineering targeted viral vectors for gene therapy.</a> Nature reviews. Genetics. 8, 573-587 (2007).</li><li>Crystal, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+an+adenovirus+containing+the+human+CFTR+cDNA+to+the+respiratory+tract+of+individuals+with+cystic+fibrosis.">Administration of an adenovirus containing the human CFTR cDNA to the respiratory tract of individuals with cystic fibrosis.</a> Nat. Genet. 8, 42-51 (1994).</li><li>Merkel, O. M., Zheng, M., Debus, H., Kissel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+gene+delivery+using+polymeric+nonviral+vectors.">Pulmonary gene delivery using polymeric nonviral vectors.</a> Bioconjugate Chemistry. 23, 3-20 (2012).</li><li>Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+humoral+immune+responses+to+viral+antigens+create+barriers+to+lung-directed+gene+therapy+with+recombinant+adenoviruses.">Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses.</a> J. Virol. 69, 2004-2015 (1995).</li><li>Liu, Q., Muruve, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+the+inflammatory+response+to+adenovirus+vectors.">Molecular basis of the inflammatory response to adenovirus vectors.</a> Gene Ther. 10, 935-940 (2003).</li><li>Pfeifer, C., Aneja, M. K., Hasenpusch, G., Rudolph, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+serotype+9-mediated+pulmonary+transgene+expression:+effect+of+mouse+strain,+animal+gender+and+lung+inflammation.">Adeno-associated virus serotype 9-mediated pulmonary transgene expression: effect of mouse strain, animal gender and lung inflammation.</a> Gene Ther. 18, 1034-1042 (2011).</li><li>Wallace, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A+regulates+innate+immune+and+proteolytic+responses+to+cigarette+smoke+exposure+in+the+lung.">Protein phosphatase 2A regulates innate immune and proteolytic responses to cigarette smoke exposure in the lung.</a> Toxicol. Sci. 126, 589-599 (2012).</li><li>Wallace, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Phosphatase+2a+(Pp2a)+Regulates+Innate+Immune+and+Proteolytic+Responses+to+Cigarette+Smoke+Exposure+in+the+Lung.">Protein Phosphatase 2a (Pp2a) Regulates Innate Immune and Proteolytic Responses to Cigarette Smoke Exposure in the Lung.</a> Toxicol. Sci. , (2012).</li><li>Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+endotracheal+intubation+and+pulmonary+functional+assessment+for+repeated+studies+in+mice.">A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice.</a> J. Appl. Physiol. 87, 2362-2365 (1999).</li></ol>

Diğer yöntemler üzerinde bu tekniğin avantajı, akciğer dokusunun kendisi içinde protein seviyeleri ve aktivite artışı, üretmesidir. Ayrıca, bu sadece hava yolları içinde kalan karşıt olarak akciğerin en uzak bölgelere nüfuz eder. Hatta tuzlu 15 ile hava lavaging sonra enjektat artan protein aktivitesi ölçüldü. Doku etkinlik analizleri protein hücreleri giriyor ve sadece fare hava boşlukları kalır olmadığını göstermektedir. Bu da fare alveoller ve hava yolları (Şekil 3...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pro-Ject</td>
 <td>Pierce Bio</td>
 <td>89850</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microsprayer</td>
 <td>Penn Century</td>
 <td>FMJ-250</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Beta-galactosidase</td>
 <td>Pierce Bio</td>
 <td>89850</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Beta-galactosidase antibody</td>
 <td>Santa Cruz Bio</td>
 <td>SC-19119</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse serum albumin</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>A3139</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ketamine/xylazine</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>K113</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

protein transfection of mouse lung

Protein ekspresyonu arttırmak araştırmacılar daha önemli biyolojik süreçlerin düzenlenmesinde 1 o proteinin fonksiyonel rolünü anlamak için olanak sağlar. Akciğerde, bu artan gen ekspresyonu 4 ile proteini düzeylerini yükselten transgenik farenin 2,3 veya viral veya non-viral vektörlerin kullanmaktadır genetik yaklaşımlar, genellikle aracılığıyla elde edilmiştir. Transgenik farenin oluşturmak için pahalı ve zaman alıcıdır ve bir transgen ya da kronik gen ifadesinin rastgele yerleştirilmesi, normal akciğer gelişimi değişmesine neden olur ve bu nedenle modelin 5 yardımcı sınırlayabilir. Koşullu ifade oluşturmak için kullanılır kronik gen 6, ters tetrasiklin kontrollü transaktivatör (rtTA) fareler ile ilişkili sorunları ortadan koşullu transgenik, kendiliğinden hava sahası genişleme 7 geliştirmek iken. Transgenik olduğu gibi, viral ve non-viral vektörlerin kullanımı 8 pahalı ve doz-D provoke edebilirBu ependent inflamatuar yanıtları sonuçları 9 yıkmak ve ifade 10 engel. Ayrıca, tekrarlı dozların etkinlik vektör 11,12 geliştirilmiş bağışıklık tepkileri ile sınırlıdır. Araştırmacılar daha az inflamasyon kışkırtmak ve akciğer 13 içinde uzun ifade var adeno-ilişkili viral (AAV) vektörleri geliştiriyoruz. Β-galaktosidaz kullanarak, doğrudan bir proteini transfeksiyon tekniği kullanılarak, akciğer içinde hızla ve etkin biçimde artıran protein ekspresyonu için bir yöntem sunulmaktadır. Bu protokol, akciğer dokusu, kendisi içine penetrasyon sağlamak için, bir lipid-bazlı transfeksiyon reaktifi 20 ul (Pro-Ject, Bio Pierce) ile saflaştırılmış protein sabit tutar karışımları. Lipozomal proteini karışımı daha sonra, bir Micro (Penn Century, Philadelphia, PA) kullanılarak, trakea ile farelerin akciğerleri içine enjekte edilir. Micro akciğerler boyunca sıvı aerosol güzel bir tüy üretir. Tekniği kullanarakBu hava ve fareler 14. alveoller boyunca enjekte proteinin homojen birikimi göstermiştir. Lipid transfeksiyon teknik etki elde etmek için protein küçük bir miktarının kullanımına olanak sağlamaktadır. Bu aksi takdirde yüksek protein idare tarafından provoke olacağını inflamatuvar yanıt sınırlar. Gerçekten de, bu tekniği kullanarak biz önemli ölçüde akciğer lavajı hücreli 15 etkilemeden akciğerde PP2A etkinliği artırmak mümkün olduğunu yayınladı. Cebine 24 saat sonra alınan hücreli akciğer lavaj kontroller ile karşılaştırılabilir olmuştur (27 ± 31 genel 4 kontrol ± 5 albümin transfekte edilmiş, her grupta N = 6). Ayrıca, transgenik bir model oluşabilir akciğer gelişimsel değişimlerin veya yapısal değişiklikler neden olmadan proteini düzeylerini artırır. Ancak, tekrar yönetimlerin ihtiyacını protein ifadesinde uzun vadeli artar etkilerini inceleyen çalışmalar için bu tekniği daha az elverişli hale getirebilir. Bu durum, özellikle tru olacaktırkısa yarı ömürlü proteinler için e.

<html> Bizim tekniğin etkinliğini göstermek amacıyla Pro-Ject transfeksiyon reaktifi 20 ul PBS içeren 50 ul içinde eritildi fare 2 ug albümini (Sigma) ile farelerin trakea enjekte etmek için bir Micro (Penn Century) kullanılmıştır. Albümin tedavi edilen fareler bir beta-galaktosidaz protein 2 ug (Pierce Biyo) ile benzer bir şekilde muamele edilmiştir farenin ile karşılaştırıldı. Yirmi dört saat sonra, fareler kurban edildi ve akciğerler histolojik analiz için hazırlandı. Bir beta-galaktosidaz i?...

Watch this Scientific Journal Video about Protein Transfection of Mouse Lung at JoVE.com

Protein Transfection of Mouse Lung

Transgenik farenin ya da viral vektörler, akciğer içinde protein ekspresyonu artırmak için kullanılmıştır. Ancak, bu teknikler teknik olarak zor, zaman alıcı ve sonuçları etkilemesi hedef dışı etkileri vardır. Bizim protein transfeksiyon protokolü bir lipid tabanlı transfeksiyon reaktif ve düzgün akciğer hücrelerine aktif bir protein sunmak için bir ultra ince Micro kullanır.

Fare Akciğer Protein Transfeksiyon

Increasing protein expression enables researchers to  better understand the functional role of that protein in regulating key  biological processes1. In ...

Research

JoVE Journal

Biology

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Gen tabancası Transfeksiyon Hipokampal Nöronlar

Biyoloji

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Sıvı Faz Kurtarma Moleküler Ağırlık Tabanlı Fraksiyonu GELFREE 8100 Fraksiyonu Sisteminin Kullanılması

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Direct Tracheal Instillation of Solutes into Mouse Lung

Fare Akciğer içine çözünenlerin Doğrudan Trakeal damlatma

Intratracheal instillations deliver solutes directly into the lungs.  This procedure targets the delivery of the instillate into the distal regions of the ...

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Fare Embriyonik Akciğer Kültür, Dallanma Moleküler Mekanizmalar değerlendirin Bir Sistem

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Görüntüleme ve Yumurtalık Kanseri Ortotopik Fare Modeli Tedavi Tedaviler

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Characterization of the Isolated, Ventilated, and Instrumented Mouse Lung Perfused with Pulsatile Flow

İzole, Havalandırmalı ve Enstrumanlı Fare Akciğer Karakterizasyonu Pulsatif Akış ile perfüze

The isolated, ventilated and instrumented mouse lung preparation allows steady and pulsatile pulmonary vascular pressure-flow relationships to be measured ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Hoechst İzolasyonu ve Karakterizasyonu Düşük CD45 Negatif Fare Akciğer Mezenkimal Kök Hücre

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

Fenotiplendirme Fare Solunum Fonksiyon<em&gt; İn Vivo</em&gt; Akciğer Yayıcı Kapasite

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods ...