Name: live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer
Uploaded: 2013-03-24T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer at JoVE.com

Мы благодарим J. Cappellani и Дж. Цю технической поддержки. Эта работа была поддержана за счет средств Национального Института Рака (U01 CA141451), Старр рака консорциума, Сьюзен Г. Комен для Лечения, Long Island 2 дня Walk для борьбы рака молочной железы, коалиция Manhasset Женщины против рака груди ко мне, и предварительно докторские стипендии с Конгрессом Режиссер груди Программа исследований рака, США ESNESN также является получателем Leslie C. Быстрый и Уильям Рэндольф Херст Фонд стипендий из школы Уотсон биологических наук. HAA была поддержана средств из Исследовательского Совета Норвегии (160698/V40 и 151 882), и Юго-Восточной региональных органов здравоохранения (2007060).

<ol>
	<li>Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumors+as+organs:+complex+tissues+that+interface+with+the+entire+organism.">Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism.</a> Dev. Cell. 18, 884-901 (2010).</li><li>Ahn, G. -. O., Tseng, D., Liao, C. -. H., Dorie, M. J., Czechowicz, A., Brown, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Mac-1+(CD11b/CD18)+enhances+tumor+response+to+radiation+by+reducing+myeloid+cell+recruitment.">Inhibition of Mac-1 (CD11b/CD18) enhances tumor response to radiation by reducing myeloid cell recruitment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8363-8368 (2010).</li><li>Tlsty, T. D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stroma+and+regulation+of+cancer+development.">Tumor stroma and regulation of cancer development.</a> Annu. Rev. Pathol. 1, 119-150 (2006).</li><li>DeNardo, D. G., Brennan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+complexity+predicts+breast+cancer+survival+and+functionally+regulates+response+to+chemotherapy.">Leukocyte complexity predicts breast cancer survival and functionally regulates response to chemotherapy.</a> Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).</li><li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance.">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21, 488-503 (2012).</li><li>Kim, J. B., Stein, R., O'Hare, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+tissue+culture+models+of+breast+cancer--+a+review.">Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-- a review.</a> Breast Cancer Res. Treat. 85, 281-291 (2004).</li><li>Gilbert, L. A., Hemann, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage-mediated+induction+of+a+chemoresistant+niche.">DNA damage-mediated induction of a chemoresistant niche.</a> Cell. 143, 355-366 (2010).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147, 983-991 (2011).</li><li>Lohela, M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+stromal+cell+dynamics+in+tumors.">Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 72-78 (2010).</li><li>Boissonnas, A., Fetler, L., Zeelenberg, I. S., Hugues, S., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+cytotoxic+T+cell+infiltration+and+elimination+of+a+solid+tumor.">In vivo imaging of cytotoxic T cell infiltration and elimination of a solid tumor.</a> J. Exp. Med. 204, 345-356 (2007).</li><li>Breart, B., Lema&#238;tre, F., Celli, S., Bousso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+intratumoral+CD8++T+cell+cytotoxic+activity+during+adoptive+T+cell+therapy+in+mice.">Two-photon imaging of intratumoral CD8+ T cell cytotoxic activity during adoptive T cell therapy in mice.</a> J. Clin. Invest. 118, 1390-1397 (2008).</li><li>Engelhardt, J. J., Boldajipour, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marginating+dendritic+cells+of+the+tumor+microenvironment+cross-present+tumor+antigens+and+stably+engage+tumor-specific+T+cells.">Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells.</a> Cancer Cell. 21, 402-417 (2012).</li><li>Brown, E., McKee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+collagen+and+its+modulation+in+tumors+in+vivo+using+second-harmonic+generation.">Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation.</a> Nat. Med. 9, 796-800 (2003).</li><li>Wyckoff, J. B., Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+macrophage-assisted+tumor+cell+intravasation+in+mammary+tumors.">Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors.</a> Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).</li><li>Yuan, F., Salehi, H. A., Boucher, Y., Vasthare, U. S., Tuma, R. F., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability+and+microcirculation+of+gliomas+and+mammary+carcinomas+transplanted+in+rat+and+mouse+cranial+windows.">Vascular permeability and microcirculation of gliomas and mammary carcinomas transplanted in rat and mouse cranial windows.</a> Cancer Res. 54, 4564-4568 (1994).</li><li>Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+tumour+pathophysiology+using+intravital+microscopy.">Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy.</a> Nat. Rev. Cancer. 2, 266-276 (2002).</li><li>Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy.">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).</li><li>Cheng, N., Lambert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+Transplantation+of+Stromal+Cells+and+Carcinoma+Cells+in+C57BL/6J.">Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J.</a> Mice. J. Vis. Exp. (54), ee2716 (2011).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.prot5563 (2011).</li><li>Sounni, N. E., Dehne, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+regulation+of+vessel+stability+by+MMP14+and+TGFbeta.">Stromal regulation of vessel stability by MMP14 and TGFbeta.</a> Dis. Model Mech. 3, 317-332 (2010).</li><li>Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+reporter+gene+transgenic+mouse+demonstrates+heterogeneity+in+hepatic+fibrogenic+cell+populations.">A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations.</a> Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).</li><li>Motoike, T., Loughna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+GFP+reporter+for+the+study+of+vascular+development.">Universal GFP reporter for the study of vascular development.</a> Genesis. 28, 75-81 (2000).</li><li>Fukumura, D., Xavier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+induction+of+VEGF+promoter+activity+in+stromal+cells.">Tumor induction of VEGF promoter activity in stromal cells.</a> Cell. 94, 715-725 (1998).</li><li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment.">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic,+long-term+in+vivo+imaging+of+tumor-stroma+interactions+in+mouse+models+of+breast+cancer+using+spinning-disk+confocal+microscopy.">Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top97 (2011).</li></ol>

Авторы не имеют конфликта интересов раскрывать. Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с утвержденным IACUC протоколов.

Ответ опухоли на системной терапии в естественных условиях могут быть значительно отличаются от тех раковых клеток в пробирке, как микросреда влияет как на острую реакцию и рецидивы 5. Одна из самых больших препятствий на пути экспликации в пути естественных химиорезистентность является сложность взаимодействия между раковыми клетками и их микроокружения. В частности, из-за солидных опухолей разработали баланс между раком и стромальных клеток, возмущения одного из компонентов, таких, как гибель клеток, которое происходит во время борьбы с раком лечения, может привести к драматическим воздействие на ткани организации. Прижизненный метод визуализации, представленная здесь позволяет прямой визуализации раковых клеток стромы-взаимодействий внутри опухоли живое, анестезированных мышей во время лечения противораковым препаратам. Мы используем вращающийся диск конфокальной микроскопии, который имеет относительную небольшую глубину проникновения (см. 17 </SUP&gt;), но наша хирургическая и маркировки методы могут быть использованы с другими видами микроскопии. Фильмы, приобретенные у этих экспериментов могут быть использованы для отслеживания процессов, которые включают в себя изменения в интенсивности флуоресценции (например, вследствие проникновения помечены населения или индукции клеточной смерти), подвижность клеток, распространение инъекции (например, для отслеживания сосудистой утечки), и со- Локализация флуоресцентные сигналы 5,12,17,20. Мы регулярно изображений мышей в течение 6 часов, а также выполняется визуализация в течение 18 часов. Это требует поддержания непрерывного мышей под наркозом для этих длительных периодов времени. При правильной анестезии, более 90% наших животных выживать 6 часов, а около 80% живут более 18 часов. Подробнее о том, как выполнить долгосрочные анестезии были опубликованы ранее 19. По нашему опыту, пять факторов являются критическими: избегать переохлаждения, избегать обезвоживания, поддержания физиологического уровня кислорода в крови насыщения, ипеть увлажненного газа-носителя для изофлурана и содержания животных на самом низком уровне анестезии, при которой они не показывают признаков боли. Для поддержания температуры тела, мы продолжаем мышей под одеяло с подогревом (при 38 ° C). Чтобы избежать обезвоживания, мы вводим небольшие объемы солевых IP в течение всей процедуры обработки изображений. Для поддержания физиологического уровня кислорода в крови насыщения, мы начнем с 21% кислорода в газе-носителе (вместо обычно используется 100%). Это позволяет увеличить вдыхаемого кислорода уровней, если мышь - часов в эксперименте - показывает снижение насыщения крови кислородом. По нашему опыту, повышение уровня кислорода ингаляционным в такое время (например, до 30-40%) почти всегда будет стабилизировать животных позволяет в течение нескольких часов дополнительных изображений. Оптимальный уровень анестезии для большинства мышей достигается с 1-1.5% изофлурана и в результате дыхания темпы 60-65/min и частоты пульса из 400-450/min. В наших экспериментах с изображениями, мы в первую очередь использовать трансгенных мышахс (MMTV-PyMT и C3 [1]-Tag), в котором мультифокальные опухоли, что позволяет для работы с изображениями нескольких поражений на разных стадиях опухолевой прогрессии параллельно в нескольких х, у позиций в течение одной сессии изображения. Это уменьшает озабоченность по поводу мыши к мыши вариации по экспериментов, направленных на выявление стадии зависит от терапевтической реакции, и уменьшает количество животных, необходимых для работы с изображениями. MMTV-PyMT модели (и других моделей спонтанной рак) проходят через прогрессивную гистопатологические этапов, которые могут быть признаны во время съемки прижизненной, хотя патологические постановка опухолевого поражения, которое может быть сделано во время прижизненного изображения отличается от, и менее подробные, чем у гистологических срезов 5,17. В отличие от трансплантации модели, как правило, отражают конце опухолей стадии лучше, так как раковые клетки, как правило, изолированы от опухолей на поздних стадиях. Такие модели, таким образом, более склонны к изучению опухоли стромывзаимодействий конце опухолей стадии, чем различия в этих взаимодействиях между разными этапами. Мы покажем примеры того, как изображение ядерные структурные изменения, которые происходят после гибели клеток индуцированной терапии. В отсутствие анти-лечение рака, эта маркировка стратегия может быть использована вместо того, чтобы изображение деление клеток на месте, выясняя, например, как клеточную пролиферацию и покоя находится под влиянием микроокружения. В будущем, флуоресцентная маркировка митохондриального компонента может сделать это возможным изображение митохондриальных изменений, которые происходят во время апоптоза клеток. В этом протоколе, мы также показали примеры того, как изображение раковых клеток, иммунных клеток взаимодействия после лечения, но и другие компоненты микросреды также могут быть визуализированы и образ. Существующие трансгенных линий репортер стромальные компоненты включают в себя тех, для фибробластов (например,., FSP1-EGFP 17, αSMA RFP-21, COL1A1-EGFP 21) или клеток сосудистой (например, Tie2-GFP 22; VEGF-GFP 23). Прижизненные изображения позволяет в режиме реального времени визуализации взаимодействий и процессов, которые происходят в естественных условиях после введения химиотерапии. С технологией в настоящее время, мы добились значительного прогресса в понимании того, как миелоидных клеток влияют терапевтический эффект, однако, поскольку микроокружение опухоли настолько сложен, основные достижения по-прежнему необходимо, чтобы начать копаться механистически в процессах, лежащих в основе экологически опосредованные лекарственной устойчивостью. Одним из наиболее важных достижений по-прежнему требуется является определение лучшего маркеров для конкретных популяций клеток. Важность лучше маркеры хорошо иллюстрируется с двумя из самых известных стромальных компонентов клетки микроокружения опухоли молочной железы, фибробласты и клетки иммунной системы. α-актин гладких мышц (αSMA) часто используются для идентификациифибробластов, но белок выражается также гладкомышечных клеток сосудов и клеток миоэпителиальных 24. Таким образом, хотя αSMA-GFP мышей репортер существует, определение конкретных типов клеток бытие во время следующих прижизненных изображений эксперимент является сложной задачей. Кроме того, одним флуоресцентных маркеров, таких как EGFP выражается в C-FMS промоутер часто идентификации нескольких субпопуляций клеток иммунной 12,17. Таким образом, хотя можно было бы идеально, как использовать один маркер для определения конкретного типа клеток сложности основных биология представляет собой серьезную проблему при использовании данного подхода. Один частичного решения этой проблемы является использование инъекционных метки для дальнейшей дифференциации субпопуляций клеток, экспрессирующих флуоресцентные же репортер. Например, люминесцентные декстраны будут взяты макрофагов и может быть использован для обозначения макрофагов субпопуляции, которые помечены C-FMS-EGFP и Fsp1-EGFP трансгенных мышей Репортер <sup&gt; 17. Антитела, конъюгированные с флуоресцентными зондами были также использованы для определения конкретных групп населения (например Gr1-позитивной популяции миелоидных клеток, помеченных C-FMS-EGFP Репортер 17). В отличие от опухоли кривые отклика порожденных суппорта измерений, которые предоставляют мало информации о механистической, как и почему опухоли реагировать на введении терапевтических или гистологического серии, полученные из тканей собраны в различные моменты времени, которые требуют больших когорт животных, наша техника обеспечивает прямой количественной оценке информации на динамику гибели клеток и взаимодействия стромальных клеток с раковыми клетками в небольших группах. Таким образом, преимущество использования процедуры сообщили здесь в том, что она обеспечивает динамическую информацию о наркотиках ответы в контексте нетронутыми микроокружения опухоли в режиме реального времени. Такая информация может привести к важным понимание глубинных процессов, которые управляют терапевтический ответ 5 &lt;/ SUP&gt;.

Солидные опухоли состоят из двух основных отсеков: раковых клеток и стромальных компонентов (как клеточного, так и непористые), которые помогают в поддержании благоприятных условий для роста опухоли 1. Эти стромальные компоненты играют важную роль в развитии, прогрессии и метастазированию многих видов рака, в том числе молочной железы 2-5. Стромальных среды также влияет на терапевтический ответ 2,4,5. Таким образом, определение того, как раковые клетки реагируют на традиционные и новые методы лечения в рамках нетронутыми микросреда имеет важное значение для углубления нашего понимания биологии рака и улучшение текущих терапевтических стратегий. Кроме того, в определении того, как раковые клетки стромы-взаимодействий изменится после введения терапии имеет решающее значение для понимания биологии опухолевого рецидива. Органотипической совместного культивирования системы были полезны для изучения опухоли стромы взаимодействия <sдо&gt; 6, но очевидно, что методы, в настоящее время не может успешно воспроизводят нетронутыми микроокружения опухоли в пробирке, в частности, в отношении сосудистой функции и набор иммунных клеток. Действительно, рак ответы на методы лечения, которые наблюдаются в пробирке зачастую значительно отличаются от наблюдаемых в естественных условиях, где микросреда цела 5. Таким образом, в естественных условиях модели для изучения опухоли стромы взаимодействия и их влияние на терапевтический ответ может лучше отражают клинически значимые механизмы 7. Основным средством изучения ответов на противораковой терапии в естественных условиях прошли через измерения размеров опухоли и гистологического исследования тканей, полученных от животных, получавших или пациентов. Тем не менее, достижения в области микроскопии и флуоресцентной журналистам в течение последних двух десятилетий позволили визуализации меж-и внутриклеточных процессовс высоким разрешением в живых, анестезии животных (прижизненных изображений) 8. Эти технологии прижизненной микроскопии доказано, что особенно ценно для пространственного и временного рассекает в динамике естественных условиях опухолевой стромы-взаимодействий на клеточном и субклеточном разрешение 8,9. Процессы, которые были распутать прижизненных изображений включают противоопухолевых Т-клеточной цитотоксичности 10,11, взаимодействие между Т-клеток и клеток миелоидной 12, динамика изменений в составе коллагена и организации после терапевтического лечения 13, макрофаг-зависимого рака и метастазов intravasation 14 и сосудистую проницаемость 15. Существуют три основных требования к прижизненной визуализации. Они включают в себя соответствующую подготовку и экспозиции тканей для работы с изображениями, флуоресцентная маркировка тканевых компонентов интересов, и парные микроскопии-камера сystem способна получения изображений 16. Наиболее распространенные стратегии, используемые для удовлетворения этих требований относятся: 1) гетеротопической препараты (например, прививки ухо или глаз орбитальный), постоянный изображения окна, или экстериоризации препараты (например, спины лоскут кожи), 2) трансгенные флуоресцентные журналистам и.. флуоресцентные инъекций для обозначения тканей компонентов и 3) многофотонное или конфокальной микроскопии систем в паре с фотоумножителя или прибор с зарядовой связью (ПЗС) камеры, соответственно, 9. Мы используем хирургическим подготовленную модель кожный лоскут, чтобы разоблачить паховых молочных желез для работы с изображениями в анестезии животных, которые выражают трансгенов кодирующие флуоресцентные журналистам. Изображения получены в течение 12 до 40 часов с использованием усиленного CCD (ICCD) камеры в паре с четырех-лазер вращающийся диск конфокальной микроскопии системы 17. Изображения таким образом, позволило нам изучить такие процессы, как в естественных условиях распространение наркотиков, зависит от стадии СНemotherapeutic ответы, типа, вызванной химиотерапией гибель клеток, и поведение клеток миелоидного 5. Мы предоставляем протокол о прижизненных изображений ответы раковых клеток к противораковой терапии и опухоли стромы-взаимодействий в мышиных моделях рака молочной железы. Этот протокол может быть использован для отслеживания поведения и смерти обоих раковых клеток и стромальных компонентов с широким спектром трансгенных и инъекционные флуоресцентные метки в обоих трансгенных и трансплантации модели для периода до 40 часов за один сеанс визуализации.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Реагент </td></tr><tr><td> MMTV-PyMT мышей </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 2374 </td><td></td></tr><tr><td> C3 (1)-тегов мышей </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 13591 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-ECFP мышей </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 3773 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-H2B-EGFP мышей </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 5418 </td><td></td></tr><tr><td> 1 х PBS </td><td> Сделано в доме </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 MD декстрана, Fluorescein-сопряженных </td><td> Invitrogen </td><td> D-7137 </td><td> Развести в дН 2 O (4 мг / мл, хранят при температуре -20 ° C); разбавленного до 1 мг / мл в 1 х PBS </td></tr><tr><td> 10 кДа декстрана, Alexa Fluor 647-сопряженных </td><td&gt; Invitrogen </td><td> D-22914 </td><td> Развести в дН 2 O (4 мг / мл, хранят при температуре -20 ° C); разбавленного до 1 мг / мл в 1 х PBS </td></tr><tr><td> Доксорубицина гидрохлорид </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 44583 </td><td> Развести в дН 2 O и хранить при температуре 4 ° С; разводить в 1 х PBS </td></tr><tr><td> Isothesia (Isoflurane) </td><td> Батлер Animal Health питания </td><td> 029450 </td><td> 250 мл </td></tr><tr><td> Пропидия йодид </td><td> Invitrogen </td><td> P3566 </td><td> 1 мг / мл; разбавленный 1:15 в 1 х PBS </td></tr><tr><td> Азот </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Кислород </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Оборудование </td></tr><tr><td> 18G х 1 ½ &quot;регулярные иглы конические </td><td> BD </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> μManager </td><td> Vale Lab, UCSF </td><td> <a href="www.micro-manager.org" target="_blank">www.micro-manager.org</a> </td><td> ПО с открытым кодом </td></tr><tr><td> Тампоном, смоченным спиртом </td><td> BD </td><td> 326895 </td><td> 70% тампоны изопропилового спирта </td></tr><tr><td> Анестезия системы </td><td> Молекулярные продукты Imaging, Ко </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Крышка стекла </td><td> Гранулирование </td><td> 2940-245 </td><td> № 1, ½, 24x50 мм; дезинфицировать 70% изопропиловый спирт салфетки </td></tr><tr><td> Пасности марлевые тампоны (стерильные) </td><td> Кендалл </td><td> 6939 </td><td></td></tr><tr><td> Предметные стекла микроскопа </td><td> Гранулирование </td><td> 2948-75x25 </td><td> Предварительно очищенную, если предварительно не очищены, дезинфекция с 70% изопропиловый спирт салфетки </td></tr><tr><td> Закаленные штрафа ножницы </td><td> Средства изобразительных наук </td><td> 14090-11 </td><td> 2 пары, нержавеющая сталь, острый острыми наконечниками, прямой наконечник, 26 мм передний край, 11 см в длину </td></tr><tr><td> Подогрев одеяло </td><td> Гаймар Industries </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Горячий шарик стерилизатор </td><td> Средства изобразительных наук </td><td> 18000-45 </td><td> Включите примерно за 30 минут до использования; стерилизации инструментов&gt; 200 ° C в течение 30 секунд </td></tr><tr><td> Imaris </td><td> Bitplane </td><td> <a href="www.bitplane.com" target="_blank">www.bitplane.com</a> </td><td></td></tr><tr><td> Krazy Glue </td><td> Элмер продукты </td><td> KG484 </td><td></td></tr><tr><td> Лаборатория ленты (½ &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Лаборатория ленты (1 &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Крышка дляКулер пенополистирола доставки </td><td></td><td></td><td> Это будет использоваться в качестве хирургического платформы </td></tr><tr><td> Micro диссекции </td><td> Roboz </td><td> RS-5153 </td><td> 1x2 зубы, небольшим изгибом, наконечник 0,8 мм шириной, 4 &quot;, длина </td></tr><tr><td> Micro диссекции </td><td> Roboz </td><td> RS-5135 </td><td> Зубчатые, небольшим изгибом, наконечник 0,8 мм ширины; 4 &quot;, длина </td></tr><tr><td> Микроскоп </td><td></td><td></td><td> Прядильной диск конфокальной, XYZ Piezo этапе, epifluourescence capablility 17,25 </td></tr><tr><td> Вставка столик микроскопа </td><td> Прикладных научных Инструменты </td><td></td><td> Пользовательские сфабрикованы, с двумя круглыми портами изображений </td></tr><tr><td> MouseOx оксиметр, программное обеспечение и датчики </td><td> STARR Life Sciences </td><td> <a href="www.starrlifesciences.com" target="_blank">www.starrlifescience</a>s.com </td><td></td></tr><tr><td> Nalgene Супер Versi-Dry лаборатории soakers </td><td> Thermo Scientific </td><td> 74218-00 </td><td> Нарезать четверти для облицовки хирургической платформы </td></tr><tr><td> Распылитель </td><td> Salter Labs </td><td> 8901 </td><td> Используется для увлажнения газов, предотвращает раздражение легочной ткани </td></tr><tr><td> Slip-наконечник одноразовый шприц туберкулином (1 мл) </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Surflo крылатых вливания </td><td> Terumo </td><td> SV-23BLK </td><td> 23G х ¾ &quot;ультра тонкой иглой, 12&quot; трубы </td></tr><tr><td> Бетадин Spray </td><td> Purdue Pharma </td><td> BASP3H </td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer

Микроокружение опухоли играет ключевую роль в опухолевой инициации, прогрессии, метастазы, и ответ на противораковое лечение. Трехмерная совместного культивирования системы часто используются для экспликации опухоли стромы взаимодействия, включая их роль в препарат ответы. Тем не менее, многие из взаимодействий, которые происходят в естественных условиях в неповрежденных микроокружения не могут быть полностью воспроизведены в этих параметров в лабораторных условиях. Таким образом, прямой визуализации этих процессов в режиме реального времени стала важным инструментом для понимания опухоли ответов на лечение и выявление взаимодействия между раковыми клетками и стромой, которые могут влиять на эти ответы. Здесь мы предлагаем метод использования вращающийся диск конфокальной микроскопии живых, анестезированных мышей непосредственно наблюдать распространение наркотиков, раковой клетке реакций и изменений в опухоли стромы взаимодействия после введения системной терапии в модели рака молочной железы. Мы описываем процедуры labeliнг различных компонентов опухоли, лечение животных для наблюдения терапевтической реакции, и хирургические процедуры для экспонирования опухолевых тканей для работы с изображениями до 40 часов. Результаты, полученные из этого протокола замедленной фильмы, в которых такие процессы, как наркотик инфильтрации, смерть раковых клеток и стромальных миграции клеток можно оценить с помощью программного обеспечения для анализа изображений.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer at JoVE.com

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Мы описываем метод визуализации ответ на анти-лечения рака<em&gt; В естественных условиях</em&gt; И в одной резолюции клетки.

Жить изображений на наркотики Ответы на микроокружение опухоли в мышиных моделях рака молочной железы

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

Метод Роман противоракового препарата развитию опухоли использованием эксплантатов хирургической Образцы


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Многофотонная изображений опухолевой инвазии сотовый в Ортотопическая Модель мыши устного плоскоклеточный рак

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

В естественных условиях Биолюминесценция изображения опухоли Гипоксия Динамика груди метастазы рака мозга у мышей

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

MAME Модели 4D Онлайн-клеточного изображения опухоли: микроокружение взаимодействия, что воздействие злокачественной прогрессии

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Мульти-модальных изображений ангиогенеза в обнаженной модели крысы из груди метастазы рака костей с помощью магнитного резонанса, компьютерной томографии Объемные и ультразвуковые

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Время изображений в заданный промежуток первичной предраковых эпителиальные клетки молочной железы, полученных из генно-инженерных мышей модели рака молочной железы

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

MRI and PET in Mouse Models of Myocardial Infarction

МРТ и ПЭТ в мыши модели инфаркта миокарда

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Инициирование метастатического рака молочной железы с помощью таргетинга из эпителия протоков с аденовируса-Cre: роман Трансгенные мыши Модель рака молочной железы

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Молекулярная профилирования из инвазивным опухоли микроокружения в 3-мерной модели клеток колоректального рака и<em&gt; Экс естественных</em&gt; Фибробласты