Name: live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer
Uploaded: 2013-03-24T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer at JoVE.com

Vi tackar J. Cappellani och J. Qiu för teknisk support. Detta arbete stöddes av medel från National Cancer Institute (U01 CA141451), den Starr Cancer Consortium, Susan G. Komen för Cure, Long Island 2 dag promenad för att bekämpa bröstcancer, Manhasset Kvinnors Coalition Against Breast Cancer för mig, och en doktorander stipendium från congressionally Riktad Breast Cancer Research Program, är USA till ESNESN även mottagaren av Leslie C Snabb och William Randolph Hearst Foundation Fellowships från Watson School of Biological Sciences. HAA stöddes av medel från Norges forskningsråd (160698/V40 och 151.882), och sydöstra regionala hälsovårdsmyndigheter (2.007.060).

<ol>
	<li>Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumors+as+organs:+complex+tissues+that+interface+with+the+entire+organism.">Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism.</a> Dev. Cell. 18, 884-901 (2010).</li><li>Ahn, G. -. O., Tseng, D., Liao, C. -. H., Dorie, M. J., Czechowicz, A., Brown, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Mac-1+(CD11b/CD18)+enhances+tumor+response+to+radiation+by+reducing+myeloid+cell+recruitment.">Inhibition of Mac-1 (CD11b/CD18) enhances tumor response to radiation by reducing myeloid cell recruitment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8363-8368 (2010).</li><li>Tlsty, T. D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stroma+and+regulation+of+cancer+development.">Tumor stroma and regulation of cancer development.</a> Annu. Rev. Pathol. 1, 119-150 (2006).</li><li>DeNardo, D. G., Brennan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+complexity+predicts+breast+cancer+survival+and+functionally+regulates+response+to+chemotherapy.">Leukocyte complexity predicts breast cancer survival and functionally regulates response to chemotherapy.</a> Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).</li><li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance.">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21, 488-503 (2012).</li><li>Kim, J. B., Stein, R., O'Hare, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+tissue+culture+models+of+breast+cancer--+a+review.">Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-- a review.</a> Breast Cancer Res. Treat. 85, 281-291 (2004).</li><li>Gilbert, L. A., Hemann, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage-mediated+induction+of+a+chemoresistant+niche.">DNA damage-mediated induction of a chemoresistant niche.</a> Cell. 143, 355-366 (2010).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147, 983-991 (2011).</li><li>Lohela, M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+stromal+cell+dynamics+in+tumors.">Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 72-78 (2010).</li><li>Boissonnas, A., Fetler, L., Zeelenberg, I. S., Hugues, S., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+cytotoxic+T+cell+infiltration+and+elimination+of+a+solid+tumor.">In vivo imaging of cytotoxic T cell infiltration and elimination of a solid tumor.</a> J. Exp. Med. 204, 345-356 (2007).</li><li>Breart, B., Lema&#238;tre, F., Celli, S., Bousso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+intratumoral+CD8++T+cell+cytotoxic+activity+during+adoptive+T+cell+therapy+in+mice.">Two-photon imaging of intratumoral CD8+ T cell cytotoxic activity during adoptive T cell therapy in mice.</a> J. Clin. Invest. 118, 1390-1397 (2008).</li><li>Engelhardt, J. J., Boldajipour, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marginating+dendritic+cells+of+the+tumor+microenvironment+cross-present+tumor+antigens+and+stably+engage+tumor-specific+T+cells.">Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells.</a> Cancer Cell. 21, 402-417 (2012).</li><li>Brown, E., McKee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+collagen+and+its+modulation+in+tumors+in+vivo+using+second-harmonic+generation.">Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation.</a> Nat. Med. 9, 796-800 (2003).</li><li>Wyckoff, J. B., Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+macrophage-assisted+tumor+cell+intravasation+in+mammary+tumors.">Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors.</a> Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).</li><li>Yuan, F., Salehi, H. A., Boucher, Y., Vasthare, U. S., Tuma, R. F., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability+and+microcirculation+of+gliomas+and+mammary+carcinomas+transplanted+in+rat+and+mouse+cranial+windows.">Vascular permeability and microcirculation of gliomas and mammary carcinomas transplanted in rat and mouse cranial windows.</a> Cancer Res. 54, 4564-4568 (1994).</li><li>Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+tumour+pathophysiology+using+intravital+microscopy.">Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy.</a> Nat. Rev. Cancer. 2, 266-276 (2002).</li><li>Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy.">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).</li><li>Cheng, N., Lambert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+Transplantation+of+Stromal+Cells+and+Carcinoma+Cells+in+C57BL/6J.">Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J.</a> Mice. J. Vis. Exp. (54), ee2716 (2011).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.prot5563 (2011).</li><li>Sounni, N. E., Dehne, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+regulation+of+vessel+stability+by+MMP14+and+TGFbeta.">Stromal regulation of vessel stability by MMP14 and TGFbeta.</a> Dis. Model Mech. 3, 317-332 (2010).</li><li>Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+reporter+gene+transgenic+mouse+demonstrates+heterogeneity+in+hepatic+fibrogenic+cell+populations.">A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations.</a> Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).</li><li>Motoike, T., Loughna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+GFP+reporter+for+the+study+of+vascular+development.">Universal GFP reporter for the study of vascular development.</a> Genesis. 28, 75-81 (2000).</li><li>Fukumura, D., Xavier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+induction+of+VEGF+promoter+activity+in+stromal+cells.">Tumor induction of VEGF promoter activity in stromal cells.</a> Cell. 94, 715-725 (1998).</li><li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment.">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic,+long-term+in+vivo+imaging+of+tumor-stroma+interactions+in+mouse+models+of+breast+cancer+using+spinning-disk+confocal+microscopy.">Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top97 (2011).</li></ol>

Författarna har inga intressekonflikter att lämna ut. Samtliga djurförsök har utförts i enlighet med IACUC godkända protokoll.

Svaren av tumörer på systemiska behandlingar in vivo kan vara dramatiskt annorlunda med de av cancerceller in vitro, eftersom mikromiljön påverkar både akuta svaret och återfall 5. Ett av de största hindren för explicating in vivo chemoresistance vägar är komplicerade samspelet mellan cancerceller och deras mikromiljö. I synnerhet, eftersom solida tumörer har utvecklat en balans mellan cancer och stromaceller, perturbationer av en komponent, såsom celldöd som sker under anti-cancerbehandling, kan resultera i dramatiska effekter på vävnad organisation. Den intravital bildteknik som här möjliggör direkt visualisering av cancer cell-stroma interaktioner inom tumörerna hos levande, bedövade möss under behandling med anti-cancerläkemedel. Vi använder spinnskivan konfokalmikroskopi, vilket har en relativt begränsad penetrationsdjup (se 17 </sup&gt;), men våra kirurgiska och märkning tekniker kan användas med andra typer av mikroskopi. Filmer som förvärvats från dessa experiment kan användas för att spåra processer som inkluderar förändringar i fluorescensintensitet (t.ex. på grund av infiltration av en märkt population eller induktion av celldöd), cellmotilitet, distribution av injicerbara (t.ex. för att spåra vaskulär läckage) och co- lokalisering av fluorescerande signaler 5,12,17,20. Vi rutinmässigt image möss för över 6 timmar och även utfört imaging i över 18 timmar. Detta kräver upprätthållande mössen kontinuerligt under anestesi för dessa långa tidsperioder. Med rätt anestesi, över 90% av våra djur överlever 6 timmar, och ca 80% överlever under 18 timmar. Detaljer om hur man utför en långsiktig anestesi har publicerats tidigare 19. Enligt vår erfarenhet fem faktorer är kritiska: undvika hypotermi, undvika uttorkning, upprätthålla fysiologiska blodet syremättnad, usjunger fuktad bärgas för isofluran, och hålla djuren på den lägsta nivån av anestesi vid vilken de inte visar tecken på smärta. För att upprätthålla kroppstemperaturen håller vi möss i en uppvärmd filt (vid 38 ° C). För att undvika uttorkning, injicera vi små volymer av saltlösning ip hela avbildning förfarande. För att bibehålla fysiologiska blodet syremättnad, börjar vi med 21% syre i bärgasen (snarare än vanliga 100%). Detta ger oss möjlighet att öka inhalerade syrenivåer om en mus - timmar i ett experiment - visar en minskning i blodet syrgasmättnad. I vår erfarenhet, öka inhalerade syrenivåer vid sådan tidpunkt (t.ex. 30-40%) nästan alltid kommer att stabilisera djuret möjliggör timmar av ytterligare avbildning. Den optimala nivån av anestesi är för de flesta möss uppnås med 1-1,5% isofluran och resulterar i andningsljud andelen 60-65/min och puls andelen 400-450/min. I våra imaging experiment använder vi främst transgen musmodells (MMTV-PyMT och C3 [1] Tag) där tumörer är multifokala, vilket möjliggör avbildning av multipla lesioner i olika stadier av tumörprogression parallellt på flera x-, y positioner under en enda avbildning session. Detta minskar oro mus-till-mus variation med avseende på experiment som syftar till att identifiera stadiet beroende terapeutiska responser, och minskar antalet djur som behövs för avbildning. MMTV-PyMT modell (och andra spontana cancer modeller) går igenom progressiva histopatologiska steg som kan kännas igen under intravital avbildning, även om patologiska iscensättningen av tumör lesioner som kan göras under intravital avbildning skiljer sig från, och mindre detaljerad än den för histologiska snitt 5,17. Däremot transplantation modeller tenderar att återspegla sent stadium tumörer bäst, eftersom cancerceller vanligen isolerade från avancerade tumörer. Sådana modeller är därför mer mottagliga för att studera tumörer stromainteraktioner av sena stadium tumörer än skillnader i dessa interaktioner mellan olika stadier. Vi visar exempel på hur bilden nukleära strukturella förändringar som inträffar efter celldöd inducerad av behandling. I frånvaro av anti-cancerbehandling, kan denna märkning strategi istället användas för att avbilda celldelning in situ belysa, exempelvis hur cellproliferation och dvala påverkas av mikromiljön. I framtiden kan fluorescerande märkning av mitokondriella komponenter gör det möjligt att avbilda mitokondriella förändringar som sker under apoptotisk celldöd. I detta protokoll har vi visat också exempel på hur man kan bilden cancer cell-immunceller interaktioner efter terapi, men andra microenvironmental komponenter kan också visualiseras och avbildas. Befintliga transgena reporter linjer för stromala komponenter innefattar de för fibroblaster (t.ex.., FSP1-EGFP 17, αSMA-RFP 21, COL1A1-EGFP 21) eller celler i vaskulaturen (t.ex. Tie2-GFP 22, VEGF-GFP 23). Intravital avbildning möjliggör realtid visualisering av interaktioner och processer som sker in vivo efter administrering av kemoterapi. Med den teknik som för närvarande finns tillgängliga, har vi gjort stora framsteg i att förstå hur myeloida celler påverkar terapeutiskt svar, men eftersom tumören mikromiljön är så komplex, är stora framsteg fortfarande behövs för att börja gräva mekanistiskt in i processer som ligger bakom miljö-medierad resistens. En av de viktigaste framstegen fortfarande krävs är att identifiera bättre markörer för specifika cellpopulationer. Vikten av bättre markörer är väl illustreras med två av de mest framstående stromacellinjer komponenter i brösttumör mikromiljön, fibroblaster och immunceller. α-glattmuskelaktin (αSMA) används ofta för att identifierafibroblaster, men proteinet uttrycks också av vaskulära glatta muskelceller och myoepithelial celler 24. Även om αSMA-GFP reporter möss finns bestämma den specifika celltypen som en följd av under ett intravital avbildning experiment är utmanande. På samma sätt kommer en enda fluorescerande markör såsom EGFP uttryckt under c-fms-promotorn identifiera ofta flera subpopulationer av immunceller 12,17. Även om man skulle helst vilja använda en enda markör för att identifiera en specifik celltyp komplexiteten i den underliggande biologin är en stor utmaning i att använda denna metod. En partiell lösning på detta problem är att använda injicerbara etiketter för att ytterligare differentiera subpopulationer av celler som uttrycker samma fluorescerande reporter. Exempelvis fluorescerande dextraner tas upp av makrofager och kan användas för att märka de makrofag subpopulationer som är märkta av c-fms-EGFP och Fsp1-EGFP transgena möss reporter <sup&gt; 17. Antikroppar konjugerade med fluorescerande prober har också använts för att identifiera specifika subpopulationer (t.ex. Gr1-positiva populationen av myeloida celler märkta med c-fms-EGFP reporter 17). Till skillnad från tumör svarskurvor genereras av bromsok mätning, som ger lite mekanistisk information om hur eller varför tumörer svarar på den administrerade terapeutiska eller histologisk serier härrör från vävnader skördats vid olika tidpunkter som kräver stora kohorter av djur, ger vår teknik direkt, kvantifierbar information på dynamiken i celldöd och på växelverkan av stromala celler med cancerceller i små kohorter. Således är fördelen med att använda det förfarande som rapporterats här att det ger dynamisk information om läkemedels svar i samband med en intakt tumör mikromiljö i realtid. Sådan information kan leda till viktiga insikter i de underliggande processer som driver terapeutiska svar 5 &lt;/ Sup&gt;.

Solida tumörer består av två stora avdelningar: cancerceller och de stromala beståndsdelar (både cellulära och icke-cellulära) som hjälper till att upprätthålla en lämplig miljö för tumörtillväxt 1. Dessa stromala komponenter spelar avgörande roller i utvecklingen, utveckling och metastasering av många typer av cancer, däribland bröst 2-5. Den stromala miljö påverkar också terapeutiska responser 2,4,5. Sålunda, bestämma hur cancerceller svarar på konventionella och nya terapier inom ramen för den intakta mikromiljön är viktig för att främja vår förståelse av cancer biologi och förbättra dagens terapeutiska strategier. Dessutom definierar hur cancer cell-stroma interaktioner förändras efter administrering av behandlingen är avgörande för att förstå biologi tumörrecidiv. Organotypic samodling system har varit till nytta för att studera tumör-stroma interaktioner <supp&gt; 6, men det är uppenbart att de metoder som för närvarande är tillgängliga inte lyckas kan rekapitulera den intakta tumören mikromiljö in vitro, i synnerhet med avseende på vaskulär funktion och rekrytering av immunceller. Faktum cancercellinjer svar på behandlingar som observeras in vitro är ofta signifikant från dem som observerats in vivo, där mikromiljön är intakt 5. Således kan in vivo-modeller för att studera tumör-stroma interaktioner och deras inverkan på behandlingssvar bättre spegla kliniskt relevanta mekanismer 7. Det primära sättet att studera reaktioner på anti-cancerbehandling in vivo har gått igenom mätningar av tumörstorlek och histologisk utvärdering av vävnader som härrör från behandlade djur eller patienter. Däremot har framsteg inom mikroskopi och fluorescerande reportrar under de senaste två decennierna gjort det möjligt att visualisering av inter-och intracellulära processermed hög upplösning i levande, sövda djur (intravital avbildning) 8. Dessa intravital mikroskopi tekniker har visat sig vara särskilt värdefullt för rumsligt och tidsmässigt dissekera in vivo dynamik tumör-stroma interaktioner vid cellulär och sub-cellulära upplösning 8,9. Processer som har unraveled genom intravital avbildning inkluderar anti-tumör T-cell cytotoxicitet 10,11, interaktioner mellan T-celler och myeloida celler 12, dynamiken av förändringar i kollagen sammansättning och organisation efter terapeutisk behandling 13, makrofag-beroende cancercell intravasering och metastasering 14 och vaskulär permeabilitet 15. Det finns tre huvudsakliga krav för intravital avbildning. Dessa inkluderar lämpliga förberedelser och exponering av vävnader för avbildning, fluorescerande märkning av vävnadskomponenter av intresse, och en parad mikroskopi-kamera ssystemprogram kan förvärva bilder 16. De vanligaste strategier som används för att hantera dessa krav är: 1) heterotopiska preparat (t.ex. inympning av örat eller ögat orbital), permanent avbildning fönster eller exterioriserades preparat (t.ex. rygghuden flik), 2) transgena fluorescerande reportrar och.. fluorescerande injicerbara att märka vävnadskomponenter, och 3) multiphoton eller konfokalmikroskopi system ihop med fotomultiplikatorrör eller charge-coupled device (CCD) kameror respektive 9. Vi använder en kirurgiskt preparerad modell hud flik för att exponera inguinal bröstkörteln för avbildning av sövda djur som uttrycker transgener som kodar fluorescerande reportrar. Bilder erhålls under en period av 12 till 40 timmar med en intensifierad CCD (ICCD) kamera paras ihop med en fyra-laser spinning skiva konfokalmikroskop systemet 17. Imaging på detta sätt har vi kunnat studera sådana processer som in vivo läkemedelsdistribution, steg-beroende lmemotherapeutic svar, typ av kemoterapi-inducerad celldöd och myeloid cellbeteende 5. Vi erbjuder ett protokoll för intravital avbildning av svaren cancercellinjer till anti-cancerbehandling och tumör-stroma interaktioner i musmodeller av bröstcancer. Detta protokoll kan användas för att spåra beteenden och död för både cancerceller och stromala komponenter med ett brett utbud av transgena och injicerbara fluorescerande etiketter både transgena och transplantation modeller för perioder på upp till 40 timmar i en enda avbildning session.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> MMTV-PyMT möss </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 2374 </td><td></td></tr><tr><td> C3 (1)-Tag möss </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 13.591 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-ECFP möss </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 3773 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-H2B-EGFP möss </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 5418 </td><td></td></tr><tr><td> 1 x PBS </td><td> Made in-house </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 VD Dextran, fluorescein-konjugerad </td><td> Invitrogen </td><td> D-7137 </td><td> Rekonstituera i dH 2 O (4 mg / ml, förvara vid -20 ° C), späd till 1 mg / ml i 1 x PBS </td></tr><tr><td> 10 kD Dextran, Alexa Fluor 647-konjugerad </td><td&gt; Invitrogen </td><td> D-22.914 </td><td> Rekonstituera i dH 2 O (4 mg / ml, förvara vid -20 ° C), späd till 1 mg / ml i 1 x PBS </td></tr><tr><td> Doxorubicinhydroklorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 44.583 </td><td> Rekonstituera i dH 2 O och förvara vid 4 ° C, späd i 1 x PBS </td></tr><tr><td> Isothesia (Isofluran) </td><td> Butler djurhälsa Supply </td><td> 029.450 </td><td> 250 ml </td></tr><tr><td> Propidiumjodid </td><td> Invitrogen </td><td> P3566 </td><td> 1 mg / ml, späd 1:15 i 1 x PBS </td></tr><tr><td> Kväve </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Syre </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Utrustning </td></tr><tr><td> 18G x 1 ½ &quot;vanliga koniska nål </td><td> BD </td><td> 305.196 </td><td></td></tr><tr><td> μManager </td><td> Vale Lab, UCSF </td><td> <a href="www.micro-manager.org" target="_blank">www.micro-manager.org</a> </td><td> Öppen källkod </td></tr><tr><td> Spritsudd </td><td> BD </td><td> 326.895 </td><td> 70% isopropylalkohol kompresser </td></tr><tr><td> Anestesisystem </td><td> Molecular Imaging Products, Co </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Täckglas </td><td> Corning </td><td> 2940-245 </td><td> Nr 1 ½, 24x50 mm, desinficera med 70% isopropanol våtservetter </td></tr><tr><td> Trygghet gasväv svampar (steril) </td><td> Kendall </td><td> 6939 </td><td></td></tr><tr><td> Glas mikroskopobjektglas </td><td> Corning </td><td> 2948-75x25 </td><td> Förrengöras, om inte i förväg rengöras, desinficeras med 70% isopropanol våtservetter </td></tr><tr><td> Härdade fina saxar </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14.090-11 </td><td> 2 par, rostfritt stål, vassa skarpa spetsar, rak spets, 26 mm framkant, 11 cm lång </td></tr><tr><td> Uppvärmd filt </td><td> Gaymar Industries </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hot pärla autoklav </td><td> Fine Science Tools </td><td> 18.000-45 </td><td> Slå på cirka 30 minuter före användning, sterilisera verktyg vid&gt; 200 ° C under 30 sekunder </td></tr><tr><td> Imaris </td><td> Bitplan </td><td> <a href="www.bitplane.com" target="_blank">www.bitplane.com</a> </td><td></td></tr><tr><td> Krazy Lim </td><td> Elmer produkter </td><td> KG484 </td><td></td></tr><tr><td> Laboratorium band (½ &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laboratorium band (1 &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lock tillen frigolit sjöfart kylare </td><td></td><td></td><td> Detta kommer att användas som kirurgiska plattformen </td></tr><tr><td> Micro dissekera pincett </td><td> Roboz </td><td> RS-5153 </td><td> 1x2 tänder, lätt kurva, 0,8 mm Spetsbredd, 4 &quot;längd </td></tr><tr><td> Micro dissekera pincett </td><td> Roboz </td><td> RS-5135 </td><td> Tandad, svag kurva, 0,8 mm Spetsbredd, 4 &quot;längd </td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td></td><td></td><td> Spinning-disk konfokala, XYZ Piezo skede epifluourescence capablility 17,25 </td></tr><tr><td> Mikroskop scenen insats </td><td> Tillämpad vetenskapliga instrument </td><td></td><td> Specialtillverkade, med två cirkulära imaging portar </td></tr><tr><td> MouseOx oximeter, programvara och sensorer </td><td> STARR Life Sciences </td><td> <a href="www.starrlifesciences.com" target="_blank">www.starrlifescience</a>s.com </td><td></td></tr><tr><td> Nalgene Super Versi-Dry labb soakers </td><td> Thermo Scientific </td><td> 74.218-00 </td><td> Skär i fjärdedelar för att fodra kirurgisk plattform </td></tr><tr><td> Nebulisatorn </td><td> Salter Labs </td><td> 8901 </td><td> Används för att fukta gaser, förhindrar irritation av lungvävnader </td></tr><tr><td> Slip-tip disponibla tuberkulin spruta (1 ml) </td><td> BD </td><td> 309.659 </td><td></td></tr><tr><td> Surflo bevingad infusionsset </td><td> TERUMO </td><td> SV-23BLK </td><td> 23G x ¾ &quot;ultra tunn nål, 12&quot; slang </td></tr><tr><td> Betadine Spray </td><td> Purdue Pharma </td><td> BASP3H </td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer

Tumören mikromiljö spelar en central roll i tumör initiering, progression, metastas, och svaret på cancerbehandlingar. Tredimensionella sam-odlingssystem används ofta för att explicera tumör-stroma interaktioner, inklusive deras roll i narkotika svar. Däremot kan många av det samspel som sker in vivo i den intakta mikromiljön inte helt replikeras i dessa in vitro-inställningar. Sålunda har direkt visualisering av dessa processer i realtid blivit ett viktigt verktyg för att förstå tumör svar på behandlingar och identifiera interaktioner mellan cancerceller och stroma som kan påverka dessa svar. Här ger vi en metod för att använda roterande skiva konfokalmikroskopi av levande, sövda möss att direkt observera läkemedelsdistribution, svar cancercell och förändringar i tumör-stroma interaktioner efter administrering av systemisk terapi i modeller bröstcancer. Vi beskriver förfaranden för labeling olika tumörer komponenter, behandling av djur för observation terapeutiska svar, och det kirurgiska ingreppet för att exponera tumörvävnad för avbildning upp till 40 timmar. De resultat som erhållits från detta protokoll tidsförlopp filmer, där sådana processer som drog infiltration, cancer celldöd och stromal migration kan utvärderas med hjälp av programvara bildanalys.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer at JoVE.com

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Vi beskriver en metod för avbildning av svar på anti-cancerbehandling<em&gt; In vivo</em&gt; Och vid en enda cell upplösning.

Realtidsundersökningen av Drug svar i tumören mikromiljön i musmodeller av bröstcancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

Metod för Novel läkemedel mot cancer utveckling med hjälp av tumör explants av kirurgiska preparat


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Multi-photon avbildning av tumörcellen invasion i ett Orthotopic musmodell av oral skivepitelcancer

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo bioluminescence avbildning av tumör Hypoxi Dynamics i bröstcancer metastaser i hjärnan i en musmodell

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

Mame Modeller för 4D Live-cell imaging av tumör: mikromiljö Interaktioner som påverkar malign progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Multi-modal Imaging av angiogenes i en Naken råtta modell av bröstcancer skelettmetastaser med magnetkamera, Volumetric datortomografi och ultraljud

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse avbildning av primära preneoplastiska bröstepitelialceller celler från genetiskt modifierade musmodeller av bröstcancer

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Inledande av metastaserande Bröstkarcinom genom Inriktning av Ductal epitel med adenovirus-Cre: A Novel transgen musmodell av bröstcancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molekylär profilering av Invasive tumormicroenvironmenten i en 3-dimensionell modell av kolorektal cancer celler och<em&gt; Ex vivo</em&gt; Fibroblaster

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

Högfrekvent ultraljud avbildning av Mouse Cervical lymfkörtlar

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

In vivo och ex vivo Approaches att studera äggstockscancer Metastatisk Colonization av Milky Spot Structures i Peritoneal Fett

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...