Name: an orthotopic mouse model of anaplastic thyroid carcinoma
Uploaded: 2013-04-17T13:00:00
Duration: 7 min 1 s
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Los autores desean agradecer a los Dres. Wenjun Li y Daniel Kreisel (Escuela Universitaria de Medicina de Washington en St. Louis) por su ayuda en la formación de la cirugía. RYL es apoyada por los Institutos Nacionales de Salud de subvención R01 DK068057 y el Fondo de Investigación del Presidente de la Universidad de Saint Louis.

1. Preparación de células Notas: 1) RPMI 1640 completo basado en la cultura receta medios (500 ml) contiene 435 ml RPMI 1640, 50 ml de FBS inactivado por calor, los aminoácidos no esenciales 5 ml, piruvato de sodio 5 ml, 5 ml de antibiótico antimicótico; 2) lugar matrigel a 4 º C un día antes de la recogida de células. <ol><li> Línea celular humana ATC THJ-11T 8 se cultivan en placas de cultivo de 6 pocillos y se cosechan una vez que el 80-90% de confluencia. </li><li> Precipitar las células por centrifugación a 200 g durante 4 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Aspirar los medios de comunicación y las células se resuspenden en medio RPMI 1640 [2 ml / placa de 6]. </li><li> Tome un pequeño volumen de la suspensión de células, añadir a un volumen de 0,4% de colorante azul tripán y determinar la densidad celular usando TC10 contador de células automatizado. </li><li> Calcular el volumen de suspensión celular necesario para obtener 5 x 10 5 células / ratón veces los ratones número inyectables. </li></ol> Nota: Para garantizar la publicidad<html> equiparar suspensión celular para inyección, preparar células como si se inyecta el doble del número de los ratones (por ejemplo, si la inyección de 5 ratones, a continuación, preparar la suspensión celular como si estuviera inyectando 10 ratones). <ol start="6"><li> Transferencia volumen necesario de la suspensión celular en un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Precipitar las células por centrifugación a 200 g durante 4 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Aspirar los medios de comunicación y las células se resuspenden en RPMI completo 1640. </li><li> Transfiera las células a un tubo de 1,6 ml, añadir 1 volumen de matrigel y mezclar suavemente con la pipeta lentamente dentro y fuera. </li></ol> Nota: Cada ratón recibirá 10 l de la suspensión / matrigel cóctel celular. Dado que las células 5 x 10 5 en suspensión en un volumen de 10 l inyectable se han utilizado con éxito en anteriores estudios de ATC ortotópico 9-10, utilizamos los parámetros en este informe. <ol start="10"><li> Coloque suspensión de células en hielo hasta que esté listo para su uso. </li></ol>_title Preparación &quot;&gt; 2 Mouse. <ol><li> Limpiar la zona quirúrgica, que incluye el microscopio de disección y el área circundante, limpiando todas las superficies con etanol al 70%. </li><li> Encienda las lámparas / almohadillas térmicas, donde los animales se recuperan de la cirugía. </li><li> Administrar 0,1 ml de ketamina / xilazina (cóctel de fármacos que consta de ketamina 9 mg / ml y xilazina 1mg/ml) por 10 g de peso corporal por vía intraperitoneal utilizando un 1 ml, 27G ½ &quot;jeringa de tuberculina. </li><li> Preparación para la cirugía del ratón: 1) afeitarse región del cuello de ratón (de la línea de la mandíbula hacia arriba del esternón y fuera de los brazos), 2) frote el área quirúrgica tres veces con chorhexadine cuadrados de gasa empapados, 3) scrub último hecho con betadine gasa empapada, 4 ) aplicar suavemente pomada para los ojos para evitar que los ojos se sequen. </li><li> Compruebe reflejo pedal para garantizar ratón está sedado adecuadamente. </li><li> Coloque animal en decúbito dorsal sobre una barrera de campo estéril desechable bajo el microscopio de disección y asegurar al animal en su lugar con cinta de tela. </li><li> Manos y pi Scrubsingernails a continuación, poner los guantes quirúrgicos estériles. </li><li> De una manera estéril, la cirugía abierta empacar y organizar instrumentos. </li><li> Coloque paño estéril sobre animales, dejando solo sitio quirúrgico expuesto. </li></ol> 3. Surgical Acceso a la tiroides y la inyección de células <ol><li> El uso de un estéril, desechable bisturí, hacer una incisión longitudinal de 1 a 1,5 cm a lo largo de la línea media de la garganta. </li></ol> Nota: La desviación de la línea media complica más profundo de corte para acceder a la tráquea. Bastante incisión precisa le permite tomar el pelo y cortar a través del tejido membranoso que sostiene glándulas salivales izquierdo y derecho y reduce la probabilidad de mellar o cortar grandes arterias. <ol start="2"><li> Hacer una segunda incisión en los músculos que rodean la correa de la tráquea a continuación, tire de la parte derecha de la incisión del músculo a un lado para exponer la glándula tiroides derecha. </li><li> Hemostats se pueden utilizar en este momento para mantener la capa muscular de unparte para facilitar el acceso a la glándula tiroides (Figura 1). </li></ol> Nota: Como alternativa, si el procedimiento realizado por dos miembros del personal quirúrgico, la capa muscular puede simplemente ser retenido con una pinza mientras una jeringa inyectable lista se entrega al cirujano por el personal de asistencia. <ol start="4"><li> Inyecte lentamente 10 l de suspensión celular en la glándula tiroides a la derecha con una &quot;jeringa de insulina 31G 5/16 a continuación, retire con cuidado la aguja. </li></ol> 4. Clausura del sitio quirúrgico y la recuperación del ratón <ol><li> Capa muscular de sutura con 6,0 material de sutura utilizando ya sea un estilo sutura continua o interrumpida. </li><li> Puntada de la piel de la misma manera. </li><li> Aplicar una capa de ungüento antibiótico triple directamente sobre sitio de la incisión. </li><li> Permitir animal pueda recuperarse en decúbito dorsal sobre almohadilla térmica. Una vez animal puede lograr decúbito esternal sin ayuda, que puede ser colocado de nuevo con otros ratones. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Monitoreo Post-operatorio y la recogida de tejidos <ol><li> Revise el sitio de la incisión y la salud general de los animales todos los días durante una semana después de la cirugía, a continuación, comprobar una vez por semana. Si las suturas están todavía intactas después de 14 días, se retiran. </li></ol> Nota: Los animales que presentan signos de deterioro de la salud (por ejemplo, pérdida de peso sustancial, el cabello desaliñado, dificultad para respirar) deben ser sacrificados y los tejidos tomados. <ol start="2"><li> Una vez que los ratones han llegado a un punto de tiempo después de la operación predeterminada, administrar ketamina / xilazina como se ha descrito anteriormente para sedar. </li><li> Perfundir animales intracardiaca y la cosecha de tiroides / tráquea y otros tejidos de interés (no descrita en detalle aquí). </li></ol>

<ol>
	<li>Bibby, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+models+of+cancer+for+preclinical+drug+evaluation:+advantages+and+disadvantages.">Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation: advantages and disadvantages.</a> Eur. J. Cancer. 40, 852-857 (2004).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+metastatic+mouse+models+for+anticancer+drug+discovery+and+evaluation:+a+bridge+to+the+clinic.">Orthotopic metastatic mouse models for anticancer drug discovery and evaluation: a bridge to the clinic.</a> Invest. New Drugs. 17, 343-359 (1999).</li><li>Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+models+are+necessary+to+predict+therapy+of+transplantable+tumors+in+mice.">Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice.</a> Cancer Metastasis Rev. 17, 279-284 (1998).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthotopic+model+of+anaplastic+thyroid+carcinoma+in+athymic+nude+mice.">An orthotopic model of anaplastic thyroid carcinoma in athymic nude mice.</a> Clin. Cancer Res. 11, 1713-1721 (2005).</li><li>Nucera, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+orthotopic+mouse+model+of+human+anaplastic+thyroid+carcinoma.">A novel orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid carcinoma.</a> Thyroid. 19, 1077-1084 (2009).</li><li>Todaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumorigenic+and+metastatic+activity+of+human+thyroid+cancer+stem+cells.">Tumorigenic and metastatic activity of human thyroid cancer stem cells.</a> Cancer Res. 70, 8874-8885 (2010).</li><li>Tran Cao, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+tumor+progression+in+a+fluorescent+orthotopic+mouse+model+of+thyroid+cancer.">Real-time imaging of tumor progression in a fluorescent orthotopic mouse model of thyroid cancer.</a> Anticancer Res. 30, 4415-4422 (2010).</li><li>Marlow, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+molecular+fingerprinting+of+four+new+anaplastic+thyroid+carcinoma+cell+lines+and+their+use+for+verification+of+RhoB+as+a+molecular+therapeutic+target.">Detailed molecular fingerprinting of four new anaplastic thyroid carcinoma cell lines and their use for verification of RhoB as a molecular therapeutic target.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 95, 5338-5347 (2010).</li><li>Nehs, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+Intervention+with+anti-BRAF+(V600E)+therapy+induces+tumor+regression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+human+anaplastic+thyroid+cancer.">Late Intervention with anti-BRAF (V600E) therapy induces tumor regression in an orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid cancer.</a> Endocrinology. 153, 985-994 (2012).</li><li>Nucera, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+BRAFV600E+with+PLX4720+displays+potent+antimigratory+and+anti-invasive+activity+in+preclinical+models+of+human+thyroid+cancer.">Targeting BRAFV600E with PLX4720 displays potent antimigratory and anti-invasive activity in preclinical models of human thyroid cancer.</a> Oncologist. 16, 296-309 (2011).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En nuestro modelo, los animales demostraron metástasis de tumores de tiroides y enfermedad relacionada con la caquexia y angustia respiratoria por 4 semanas después de la inyección. Al igual que con la mayoría de otros modelos ortotópico utilizando el suministro por inyección de una suspensión de células, la inyección en los tejidos circundantes y las fugas después de la inyección, que se propaga más allá del objetivo son posibles. Con eso se dice, se desconoce el potencial reconocible producida por este procedimiento es el efecto de la exposición de destino fuera de metástasis o complicaciones no relacionadas con la enfermedad. Esta es una preocupación general con la mayoría de los trasplantes de xenográfico, independientemente de la enfermedad que está siendo investigado. Sin embargo, las consecuencias no intencionadas de la metástasis pueden ser minimizados significativamente por asegurar todo el bisel de la punta de la aguja ha penetrado la membrana perfectamente superposición de la glándula tiroides y expulsar lentamente la suspensión celular. Si se observa fugas durante o después de la inyección, los animales pueden ser omitidos del estudio. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Es esencial que los animales se sometieron a perfusión antes de la recolección de la tiroides / tráquea y otros tejidos. Morfología de los tejidos y la integridad Los beneficios son dobles, 1) las células rojas de la sangre se purgarán y no saturar las muestras histológicas y 2) se conservan. Además, resecado tiroides / tráquea que tienen ya sea una masa tumoral unido o están enterrados dentro de ella se debe cortar de una manera que puntos de referencia anatómicos pueden ser identificados antes de ser incorporado para la preparación histológica. Esto reducirá drásticamente el tiempo de preparación de la muestra. En este informe se describe el crecimiento local y la invasión del tumor de tiroides avanzado después de la inyección ortotópico de células ATC. ATC metástasis puede ser investigada mediante el análisis de preparaciones histológicas de otros tejidos, utilizando tinciones histológicas estándar, tales como hematoxilina y eosina, o mediante técnicas de inmunohistoquímica utilizando células o marcadores pertinentes patología. Este sistema puede ser desarrollado por genetically modificación de las células del cáncer de tiroides con los reporteros de fluorescencia de modo que imágenes en vivo puede ser usado para monitorear la metástasis y la eficacia de los tratamientos terapéuticos.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640 cell culture media</td>
 <td>Mediatech</td>
 <td>10-041-CV</td>
 <td>Media and additives used depend on cell line</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TC10 Automated Cell Counter</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>145-0001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Matrigel</td>
 <td>Becton, Dickinson and Company</td>
 <td>354234</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Graefe Forceps, Serrated; Slight Curve, 4"</td>
 <td>Roboz</td>
 <td>RS-5135</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disposable scalpel, No. 15</td>
 <td>Feather</td>
 <td>2975#15</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Olsen Hegar Needle Holder - 4 &frac12;" delicate serrated</td>
 <td>gSource</td>
 <td>gS 21.5400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-0 nylon black monofilament suture</td>
 <td>Surgical Specialties Corporation</td>
 <td>1279B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heating Pad, reusable, 8" x 12"</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cloth tape, 1" X 10 yds</td>
 <td>Medline</td>
 <td>MIINON260101</td>
 <td>For restraining anesthetized mouse</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peanut Clipper/Trimmer</td>
 <td>Wahl</td>
 <td>8655</td>
 <td>For removing hair from surgical site</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ChlorHex-Q SCRUB 2%</td>
 <td>Penn Veterinary Supply</td>
 <td>VED1222</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Betadine</td>
 <td>Henry Schein Company</td>
 <td>6906727</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petrolatum ophthalmic ointment</td>
 <td>Dechra Veterinary Products</td>
 <td>17033-211-38</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 x 2 gauze, 12-ply</td>
 <td>Butler Animal Health Supply</td>
 <td>6936</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile Field, Barrier, 18" x 26"</td>
 <td>Busse</td>
 <td>696</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Drapes (CSR Wrap)</td>
 <td>Cardinal Health</td>
 <td>AT 21 412</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>27G &frac12;" needle</td>
 <td>Becton, Dickinson and Company</td>
 <td>309623</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>31G 5/16" needle</td>
 <td>Becton, Dickinson and Company</td>
 <td>328438</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ketamine (9 mg/ml) / xylazine (1 mg/ml) solution</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Triple antibiotic ointment</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

an orthotopic mouse model of anaplastic thyroid carcinoma

Se han establecido varios tipos de modelos animales de carcinomas de tiroides humanos, incluyendo subcutánea xenoinjerto y la implantación ortotópica de las células cancerosas en ratones inmunodeficientes. Modelos de xenoinjertos subcutáneos han sido valiosos para la detección y evaluación de nuevos tratamientos terapéuticos preclínicos. Hay un número de ventajas a la utilización de un modelo subcutáneo; 1) rápido, 2) reproducibles, y 3) el establecimiento del tumor, el crecimiento, y la respuesta a los agentes terapéuticos pueden ser verificados por la inspección visual. Sin embargo, la evidencia sustancial ha arrojado luz sobre las defi-ciencias de los modelos de xenoinjertos subcutáneos 1-3. Por ejemplo, los tratamientos medicinales que demuestran propiedades curativas en los modelos de xenoinjertos subcutáneos a menudo no tienen un impacto notable en la enfermedad humana. El microambiente del sitio de trasplante xenográfico o inyección se encuentra en el corazón de esta disimilitud. Modelos de xenoinjertos de tumor ortotópico proporcionan una más Biologicamente contexto pertinente para estudiar la enfermedad. Las ventajas de la implantación de las células enfermas o tejidos en su anatómica equivalente origen dentro de un animal huésped incluye un sitio adecuado para interacciones tumor-huésped, el desarrollo de metástasis relacionados con la enfermedad y la capacidad de examinar la influencia específica de sitio en remedios terapéuticos en investigación. Por lo tanto, los modelos de xenoinjertos ortotópico albergan valor mucho más clínica, ya que cerca se reproducen las enfermedades humanas. Por estas razones, un número de grupos han tomado ventaja de un modelo ortotópico de cáncer de tiroides como una herramienta de investigación 4-7. Aquí se describe un enfoque que establece un modelo ortotópico para el estudio de carcinoma de tiroides anaplásico (ATC), que es altamente invasiva, se resiste al tratamiento, y es mortal en prácticamente todos los pacientes diagnosticados. ATC células cultivadas se prepararon como una suspensión celular disociada en una solución que contiene una matriz de membrana basal. Un pequeño volumen es lenta injeja en la glándula tiroidea derecha. La apariencia general y la salud de los ratones se controlan para asegurar complicaciones post-operatorias y mínimos para medir penetrancia patológica del cáncer. Los ratones se sacrificaron a las 4 semanas, y los tejidos se recogieron para el análisis histológico. Los animales pueden ser tomadas en puntos de tiempo después de examinar más la progresión de avance de la enfermedad. La producción de este modelo de ratón ortotópico establece una plataforma que cumple dos objetivos: 1) promover la comprensión de la patología ATC, y 2) la pantalla agentes terapéuticos actuales y futuros para la eficacia en la lucha contra el ATC.

No se detectaron 19 tumores tiroideos invasoras de un total de 20 ratones inyectados con células ATC después de 4 semanas. En el ejemplo mostrado en la figura 2A, los ratones que recibieron una inyección ortotópica de células ATC 5X10 5 cultivados bajo condiciones adjuntos, exhiben infiltración significativa de células cancerosas dentro de la tiroides por 4 semanas después de la inyección. La naturaleza de las células invasoras ATC con una característica de las células fusiformes y células a medio y de tamaño gigante con citoplasma eosinófilo y núcleos grandes se verificó mediante hematoxilina y eosina (H &amp; E) tinción. Para la comparación, la tiroides y la tráquea de un animal de control no inyectado se muestra en la Figura 2B. Los folículos del animal no inyectada mostrar su fin, sin embargo, suelta, de asociación y tienen esencialmente una morfología redonda. Debido al pequeño tamaño de la tiroides y el uso de suministro por inyección, pueden surgir los efectos no deseados. Figura 3A ilustra lamás comúnmente observada, que es el desarrollo de una masa tumoral fuera, pero no abarca la tiroides. Esto es más que probable debido a la penetración de la aguja a través y más allá de la tiroides cuando se expulsan las células. Ocasionalmente, los ratones que presentan sin crecimiento del tumor, tanto macroscópica e histológicamente, se detectan como se muestra en la Figura 3B. Ausencia de desarrollo del tumor detectable puede ser causada por la expulsión de la suspensión de células desde el sitio de inyección y difusión en los tejidos y las cavidades vecinas. <img src="/files/ftp_upload/50097/50097fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. La exposición de la tiroides. Las etiquetas indican las glándulas tiroides derecha e izquierda que flanquean la tráquea. <img src="/files/ftp_upload/50097/50097fig2.jpg" alt="La figura 2"/> Figura 2. El examen histológico de crecimiento del tumor y eninvasión de tiroides después de la inyección con éxito. Las muestras de tejido se seccionaron a lo largo del plano coronal. A) Imagen tomada a 200X de ratón exhibe crecimiento sustancial del tumor con las células fusiformes característicos y las células a medio y de tamaño gigante con citoplasma eosinófilo y núcleos grandes en hematoxilina y eosina ( H &amp; E) tinción Tu indica la lesión primaria a partir de la cual las células tumorales invaden la tiroides B) la tráquea y de la tiroides de control de animales (imagen tomada a 100X) Tu, tumores;... S, músculo liso; Tr, la tráquea; Thy, glándula tiroides. <img src="/files/ftp_upload/50097/50097fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Los resultados no intencionales de la inyección ortotópica. Muestras de tejido fueron seccionadas por el plano coronal. A) el crecimiento del tumor periférico sin crecimiento evidente en la tiroiditisd (flecha negro, imagen tomada a 100X). B) La falta de detección de tumores en bruto (no mostrado) o el examen histológico (imagen tomada en 50X). Thy, la glándula tiroides.

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An Orthotopic Mouse Model of Anaplastic Thyroid Carcinoma

Generación de un modelo de ratón ortotópico de carcinoma de tiroides anaplásico se describe aquí. Esta técnica emplea la colocación quirúrgica de las células de cáncer de tiroides anaplásico humanos dentro de la tiroides de los ratones inmunodeficientes, creando así un entorno más clínicamente relevante para estudiar la progresión de la enfermedad, así como de pantalla intervenciones terapéuticas innovadoras.

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