Name: cryosectioning yeast communities for examining fluorescence patterns
Uploaded: 2012-12-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns at JoVE.com

Vi vill tacka Jonathan Cooper Lab vid Fred Hutchinson Cancer Research Center för tillstånd att använda deras kryostat. Detta arbete stöddes av NIH och WM Keck stiftelsen. BM är en Gordon och Betty Moore kamrat av Life Science Research Foundation. Vi är tacksamma för Daniel Gottschling för att dela hans fixering protokoll med oss.

1. Fastställande Jäst gemenskaperna <ol><li> Väx jäst samhällen på ett membranfilter (t.ex. Millipore MF membranfilter, Figur 2A). Detta protokoll motsvarar en typisk gemenskap på mindre än 2x10 8 celler på en 6 mm diameter membranfilter. </li><li> Använd en bit av Whatman 541 filterpapper för att täcka botten av en 1 cm diameter väl (Figur 2B). Detta Whatmanpapper kommer att användas som en bärare för att överföra samhället i senare skeden. Till...

<ol>
	<li>Tolker-Nielsen, T., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Organization+of+Microbial+Biofilm+Communities.">Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities.</a> Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).</li><li>Moller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+In+Situ+Gene+Expression+in+Mixed-Culture+Biofilms:+Evidence+of+Metabolic+Interactions+between+Community+Members."> In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).</li><li>Lepp, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methanogenic+Archaea+and+human+periodontal+disease.">Methanogenic Archaea and human periodontal disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).</li><li>V&#225;chov&#225;, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+developing+multicellular+yeast+colony:+spatio-temporal+expression+of+Ato1p+ammonium+exporter.">Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter.</a> Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).</li><li>Min&#225;rikov&#225;, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+Gene+Expression+in+Cells+within+Yeast+Colonies.">Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies.</a> Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).</li><li>Shou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+cooperation+in+engineered+yeast+populations.">Synthetic cooperation in engineered yeast populations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).</li><li>Momeni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+generates+a+unique+spatial+signature+in+microbial+communities.">Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities.</a> , (2012).</li><li>Kiernan, J., ed, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. , 4 (2008).</li><li>Piccirillo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rim101p/PacC+Pathway+and+Alkaline+pH+Regulate+Pattern+Formation+in+Yeast+Colonies.">The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies.</a> Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).</li></ol>

Förfarandet som presenteras här erbjuder ett sätt att inspektera den inre strukturen av jäst samhällen. Metanol fixeringssteg gör jästkolonin stela 8 och bevarar integriteten av kolonin, men det orsakar också krympning 8 som bör beaktas vid tolkning av resultaten. Vi ser vanligtvis runt 30% krympning i höjd jästkolonier, jämfört med kolonier direkt inbäddade i oktober utan att fastställa 9. För att undvika krympning, är ett alternativt tillv?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (tillval) </td></tr><tr><td> 100% Metanol </td><td> JT Baker </td><td> 9070-01 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek oktober Förening </td><td> Andwin Scientific </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Whatman Grade No 541 Kvantitativ Filterpapper </td><td> Whatman </td><td> 1541-047 </td><td></td></tr><tr><td> Millipore-MF membranfilter </td><td> Millipore </td><td> HAWP04700 </td><td></td></tr><tr><td> Kryostat </td><td> Leica </td><td> CM 1510 S </td><td></td></tr></tbody></table>

cryosectioning yeast communities for examining fluorescence patterns

Mikrober bor vanligtvis i samhällen. Den rumsliga organisation av celler i ett samhälle tros påverka överlevnad och funktion i samhället 1. Optiska sektioneringspunkter tekniker, inklusive konfokala och två-foton mikroskopi, har visat sig användbara för observation fysisk planering av bakterie-och archaeal gemenskapernas 2,3. En kombination av konfokal avbildning och fysisk sektionering av jästkolonier har avslöjat interna organisation celler 4. Dock har direkt optisk sektionering med konfokal eller två-foton mikroskopi bara kunnat nå några cellager djupt in jästkolonier. Denna begränsning är sannolikt på grund av en stark spridning av ljus från jästceller 4. Här presenterar vi en metod som baseras på fastställande och cryosectioning få rumsliga fördelningen av fluorescerande celler i Saccharomyces cerevisiae samhällen. Vi använder metanol som fixativ medletatt bevara den rumsliga fördelningen av celler. Fasta samhällen infiltrerats med oktober förening, fryst och cryosectioned i en kryostat. Fluorescens avbildning av sektionerna visar den interna organisationen av fluorescerande celler i samhället. Exempel på jäst samhällen bestående av stammar som uttrycker röda och gröna fluorescerande proteiner visar potentialerna hos cryosectioning metoden att avslöja den spatiala fördelningen av fluorescerande celler såväl som för genuttryck i jästkolonier 2,3. Även om vårt fokus har legat på Saccharomyces cerevisiae samhällen kan samma metod eventuellt användas för att undersöka andra mikrobiella samhällen.

Fluorescensbilder av vertikala tvärsnitt av jäst samhällen innehållande röd-och grön-märkta konkurrerande populationer 6 visas i figur 3. Dessa samhällen består av två prototrofa stammar av jäst och deras konkurrens om delade resurser, inklusive utrymme leder till kolumner mönster 7, som visas i deras vertikala tvärsnitt. Beslut ner till en enskild cell kan lösas på tvärsnitt. Jämför tvärsnitt av upprepade samfund erhållits med (botten) och utan (överst) metano...

Watch this Scientific Journal Video about Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns at JoVE.com

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Vi presenterar ett protokoll för frysning och cryosectioning jäst samhällen att observera inre mönster av fluorescerande celler. Metoden bygger på metanol fastställande av priser och oktober-inbäddning för att bevara den rumsliga fördelningen av celler utan att inaktivera fluorescerande proteiner i en gemenskap.

Cryosectioning Jäst gemenskapernas för att pröva Fluorescence mönster

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

Research

JoVE Journal

Biology

Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

Flash Frysning och Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

Microbial Communities in Nature and Laboratory - Interview

Mikrobiella samhällen i naturen och Laboratory - Intervju

Biology of Microbial Communities  - Interview

Biologi mikrobiella samhällen - Intervju

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

En mikroflödessystem enhet med Groove Mönster till Studera Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse avbildning av Mitos Efter siRNA Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Undersöka Conformational Dynamics av ​​membranproteiner På plats Med Site riktad Fluorescens märkning

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

En fluorescensmikroskopi-analys för övervakning Mitophagy i jästen Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Kvantitativa levande celler fluorescens-mikroskopi Analys av fissionsjäst

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Förvärva Fluorescens Time-lapse filmer av knoppande jäst och analysera Encelliga Dynamics med transplantat

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

Cryosectioning Förfarande för Microdissection av murin kolonslemhinna

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...