Name: a visual assay to monitor t6ss-mediated bacterial competition
Uploaded: 2013-03-20T12:00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition at JoVE.com

Detta arbete har finansierats av Wellcome Trust bidraget WT091939MA. Alain Filloux stöds av Royal Society.

1. Bakteriella stammar och kulturer <ol><li> Konstruera en Escherichia cell coli-mottagare (Prey, P) genom att omvandla (med standard CaCl 2 behandling eller elektroporering) 15 E. coli DH5a-celler med en plasmid som tillåter en-komplementering av lacZ-genen (tabell 1). Platta de transformerade cellerna på Luria-Bertani-agarplattor (LBA, 1,5% agar) innehållande 5-brom-4-klor-indolyl-β-D-galaktopyranosid (X-gal) vid 40 mg / ml slutlig koncentration och lämpligt antibiotikum. Inkubera vid 37 ° C över natten och följande morgon välja för blå transformanter (se § 1,3). </li><li> Odla Pseudomonas cellerna aeruginosa givare som är T6SS aktiva (D +) eller T6SS-inaktiv (D-) (tabell 1) på LBA natten vid 37 ° C. I exemplet som presenteras här använde vi en P. aeruginosa rets stam som haren konstitutivt aktiv H1-T6SS 16 och en isogen mutant med en deletion av H1-T6SS genklustret (tabell 1). </li><li> Nästa dag, förbereda en över natten flytande kultur i luftad kolv genom inokulering en klarblå klon bland E. coli-transformanter (P) från plattan beskrivs i § 1,1, i 5 ml tryptisk sojabuljong (TSB) kompletterat med lämpliga antibiotika. Växa under omröring vid 37 ° C. Fortsätt lika med en enda koloni av (D +) och av (D -) från plattan som beskrivs i § 1,2. </li></ol> 2. Konkurrens analys <ol><li> Förbered LBA plattor för nästa dag experimentet. Se till att dessa plattor ordentligt torkas (antingen nära Bunsenbrännare eller laminärt flöde skåp). Förbered en &quot;Innehåll-ingången&quot; (A-ingång) platta för stammarna (D +), (D -), och (P </strong&gt;). Förbered en &quot;Innehåll-utgång&quot; (A-utgång) platta för stammarna (D - + P) och (D + + P). Dela upp och märka plattorna därefter. </li><li> Efter odling över natten (se § 1,3), mät den optiska densiteten (OD 600 nm) av den inmatade bakteriekultur (D - D + och P) och beräkna volymen som krävs för att få en likvärdig celltäthet till 1 enhet OD 600 nm för varje stam . Varje &quot;input&quot; cellkultur (D -, D + och P) initialt samlas i en steril 1,5 ml Eppendorf-rör. </li><li> Centrifugera bakteriella proverna vid 13.000 rpm under 1 min vid rumstemperatur och häll bort supernatanten. </li><li> Återsuspendera pellets av D -, D +, och P-kulturer, i 100 pl färsk TSB genom försiktig pipettering och ympa 10 ml av varje motsvaranderande stam som en enda fläck på &quot;A-ingången&quot; platta (framställd i § 2,1). </li><li> Inokulera &quot;A-output&quot; platta (framställd i § 2,1). Närmare bestämt, blanda försiktigt 30 pl (D +) med 30 pl (P) och 30 | il av (D -) med 30 ml (P) i två separata Eppendorf rör (observera att de använda kulturerna är de som beskrivs i § 2,4) . Inokulera 20 ul av blandningarna (D + / P) och (D - / P) som enskilda fläckar på &quot;A-utdata&quot; platta. Låt fläckarna torka i närheten en Bunsenbrännare och placera plattan i en inkubator vid 37 ° C under en lämplig tidsperiod under vilken bakteriedödande sker. I fallet P. aeruginosa, är en effektiv bakteriell dödande observerades efter 5 h inkubation vid jämförelse en T6SS verksamma med en T6SS defekt stam. </li></ol> 3. Kvalitativ observation av than bakteriedödande <ol><li> Förbered LBA plattor innehållande 40 pg / ml X-gal för utläsningen av analysen. Plattorna kommer att kallas &quot;Avläsning ingång&quot; eller &quot;R-ingång&quot; för att upptäcka isolerade bakterier eller &quot;Avläsning utgång&quot; eller &quot;R-utgång&quot; att upptäcka blandade bakteriekulturer och därmed läsa dödande prestanda. Dessa plattor måste också korrekt torkas. Dela upp plattan i fyra lika stora delar på ryggen och kommentera dessa delar 0, 10 -1, 10 -2 och 10 -3, val av utspädningar av bakteriekultur att upptäcka på agarplattor (se § 3.3). Utspädningen kommer att möjliggöra en semi-kvantitativ utvärdering av den blå / vita bakterier förhållandet inom samma plats. </li><li> Samla upp med en steril ögla de individuella bakteriella fläckarna från &quot;A-ingången&quot; platta (se § 2.4) och &quot;A-output&quot; platta (se § 2,5) och återsuspendera varje plats i olika 1,5 ml Eppendorf-rör innehållande 1 ml TSB. Placera i en Eppendorf shaker blocket under 30 minuter för att resuspendera effektivtbakterier. </li><li> Bered en serie av 5 ggr 3 Eppendorf-rör innehållande 900 | il TSB och fortgå under varje återsuspenderade fläck till tio faldiga serieutspädningar upp till 10 -3. Se till att ändra pipettspetsar och virvel 5 sekunder mellan varje spädning steg. </li><li> Gå vidare till spotting av dina bakteriella spädningar upprättats i § 3,3 på väl torkade LBA-plattor innehållande 40 ng / ml X-gal genom att börja med de mest utspädda till den outspädda fjädring, vilket gör dessa &quot;R-ingång&quot; plattor för &quot;A -ingången &quot;fläckar och&quot; R-output &quot;plattor för&quot; A-output &quot;fläckar (figur 2). Vortex kort varje rör innan du fortsätter till spotting hålla en homogen bakteriesuspension. För reproducerbarhet av resultaten, fläck 20 ul i triplikat inom en kvadrant (figur 2). Den relativa torrhet din tallrik är viktigt i detta skede eftersom fläckarna måste förbli individuellt åtskilda på tallriken och inte glida mot varandra. En kvantifiering av den kompetitiva analysen är också möjligt i detta skede av experimentet. Efter steget 3,3, spridning 100 pl av utspädning 10 -3 på LBA-plattor innehållande 40 pg / ml X-gal. För reproducerbarhet av resultaten, vidare till en plätering i triplikat för varje fläck från &quot;A-utdata&quot; platta. Placera utspädning plattorna i en 37 ° C inkubator över natten (motsvarande 16 h inkubation). Fortsätt till räkningen av de blå kolonierna (P celler som förblev levande). Typiska resultat som erhölls efter 5 timmar av konkurrens visas i figur 3. </li><li> Låt plattan öppen (inget lock) i en steril zon för att tillåta absorption av vätskan i överskott inom varje fläck. </li><li> Placera plattan i en 37 ° C inkubator över natt. Under denna inkubationstid är dödande förekommer fortfarande i blandningen (D + / P) eftersom båda stammarna är fortfarande i kontakt. </li><li> Ta en bildeller skanna dina plattor för outputanalys (figur 2). När fläckarna fortfarande till stor del blå betyder det att E. E. coli har inte dödats av P. aeruginosa. Detta är fallet när E. coli blandas med en T6SS-defekt P. aeruginosa stam (D-) (Figur 2, tallrik längst ned till höger). </li></ol>

<ol>
	<li>Filloux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+type+VI+secretion+machine:+yet+another+player+for+protein+transport+across+membranes.">The bacterial type VI secretion machine: yet another player for protein transport across membranes.</a> Microbiology. 154 (6), 1570 (2008).</li><li>Cascales, E., Cambillau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+type+VI+secretion+systems.">Structural biology of type VI secretion systems.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 367 (1592), 1102 (2012).</li><li>Leiman, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+T4+tail+and+tail+fibers.">Morphogenesis of the T4 tail and tail fibers.</a> Virol. J. 7, 355 (2010).</li><li>Ballister, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+self-assembly+of+tailorable+nanotubes+from+a+simple+protein+building+block.">In vitro self-assembly of tailorable nanotubes from a simple protein building block.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (10), 3733 (2008).</li><li>Leiman, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+VI+secretion+apparatus+and+phage+tail-associated+protein+complexes+share+a+common+evolutionary+origin.">Type VI secretion apparatus and phage tail-associated protein complexes share a common evolutionary origin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (11), 4154 (2009).</li><li>Pukatzki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+VI+secretion+system+translocates+a+phage+tail+spike-like+protein+into+target+cells+where+it+cross-links+actin.">Type VI secretion system translocates a phage tail spike-like protein into target cells where it cross-links actin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (39), 15508 (2007).</li><li>Ma, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+a+Vibrio+cholerae+type+VI+secretion+effector+requires+bacterial+endocytosis+by+host+cells.">Translocation of a Vibrio cholerae type VI secretion effector requires bacterial endocytosis by host cells.</a> Cell Host Microbe. 5 (3), 234 (2009).</li><li>Hood, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+type+VI+secretion+system+of+Pseudomonas+aeruginosa+targets+a+toxin+to+bacteria.">A type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa targets a toxin to bacteria.</a> Cell Host Microbe. 7 (1), 25 (2010).</li><li>Russell, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+VI+secretion+delivers+bacteriolytic+effectors+to+target+cells.">Type VI secretion delivers bacteriolytic effectors to target cells.</a> Nature. 475 (7356), 343 (2011).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+type+VI+secretion+effector+recognition+by+a+cognate+immunity+protein.">Structural basis for type VI secretion effector recognition by a cognate immunity protein.</a> PLoS Pathog. 8 (4), e1002613 (2012).</li><li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+anti-amoebae+and+anti-bacterial+activities+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae.">Genetic analysis of anti-amoebae and anti-bacterial activities of the type VI secretion system in Vibrio cholerae.</a> PLoS One. 6 (8), (2011).</li><li>Schwarz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+type+VI+secretion+systems+have+distinct+roles+in+eukaryotic+and+bacterial+cell+interactions.">Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions.</a> PLoS Pathog. 6 (8), e23876 (2010).</li><li>Murdoch, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+opportunistic+pathogen+Serratia+marcescens+utilizes+type+VI+secretion+to+target+bacterial+competitors.">The opportunistic pathogen Serratia marcescens utilizes type VI secretion to target bacterial competitors.</a> J. Bacteriol. 193 (21), 6057 (2011).</li><li>Boyer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+bacterial+type+VI+secretion+system+by+a+genome+wide+in+silico+analysis:+what+can+be+learned+from+available+microbial+genomic+resources?.">Dissecting the bacterial type VI secretion system by a genome wide in silico analysis: what can be learned from available microbial genomic resources?.</a> BMC Genomics. 10, 104 (2009).</li><li>Maniatis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: A Laboratory Manual. , (1982).</li><li>Mougous, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+virulence+locus+of+Pseudomonas+aeruginosa+encodes+a+protein+secretion+apparatus.">A virulence locus of Pseudomonas aeruginosa encodes a protein secretion apparatus.</a> Science. 312 (5779), 1526 (2006).</li><li>Records, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+type+VI+secretion+system:+a+multipurpose+delivery+system+with+a+phage-like+machinery.">The type VI secretion system: a multipurpose delivery system with a phage-like machinery.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 24 (7), 751 (2011).</li><li>Hachani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+VI+secretion+system+in+Pseudomonas+aeruginosa:+secretion+and+multimerization+of+VgrG+proteins.">Type VI secretion system in Pseudomonas aeruginosa: secretion and multimerization of VgrG proteins.</a> J. Biol. Chem. 286 (14), 12317 (2011).</li></ol>

Vi har inget att lämna ut.

Metoden presenteras i denna artikel ger en visuell observation av T6SS-medierad baktericid / BAKTERIOSTAS aktivitet. Analysen utförs på ytan av en agarplatta. Det har tidigare visats att T6SS-beroende dödande utförd med blandad bakteriell flytande kultur är inte effektiv, sannolikt på grund av bristen på stadig kontakt mellan de två bakterierna 8. Den T6SS tros fungera med en mekanism som liknar den som används av bakteriofager för att injicera DNA i målceller 17. I flytande kultur, kan det rörliknande struktur T6SS sönder lättare kan mellan bakteriell kontakt förloras och gifter är inte effektivt levereras. När det gäller inkubationstider, de 5 första timmarna av kontakt som vi beskriver mellan givaren stam och bytet är tillräckligt att konstatera bakteriedödande mellan P. aeruginosa och E. E. coli, såsom visas i figur 3 </strong&gt;. Ändå är det lämpligt att justera inkubationstiden genom att utföra en kinetisk för att optimera de experimentella betingelserna. Eftersom denna metod är en färg baserad teknik kan de utgående resultaten äventyras genom pigmentering av givaren stammen. Till exempel i fallet med P. aeruginosa, vissa stammar producerar höga halter av färgpigment som pyocyanin och pyoverdine, som kan störa analysen avläsning, vilket gör skillnaden från bytet relativt svårt. Andra kromogena β-galaktosidas-substrat, såsom magenta-gal eller röda-gal, kan användas i stället för X-gal (Tabell 1). Den kompetitiva analysen kan använda andra reportergener för avläsning. Till exempel, har liknande analys också utförts genom användning av grönt fluorescerande protein-märkt byten 12. Vår analys, medan inte kvantitativ, ger en god indikationav T6SS verksamheten eftersom det bygger på överlevnad eller dödandet av en reporter byte. Denna teknik har den fördelen av att vara enkelt och bekvämt att utvärdera den bakteriedödande / BAKTERIOSTAS aktivitet av T6SSs från eventuella bakteriearter. Hittills har aktiviteten hos T6SS visats mot gramnegativa bakterier och ingen tydlig exempel på T6SS-känsliga grampositiva bakterier har rapporterats ännu 12. Det är också uppenbart att oförenlighet i kulturen i olika bakteriearter att testa (t.ex. tillväxt temperatur, syresättning, specifika medier) ska behandlas. Vår analys kan också användas för att utvärdera vilken av de T6SS komponenter är absolut nödvändigt eftersom även spår av ett utsöndrat toxin kan vara tillräckligt för att döda bytet. Även svag aktivitet T6SS kunde då tydligt detekteras av vår analys jämfört med standardförfarande test T6SS-beroende sekretion med odlingssupernatant och Western blotanalys. Emellertid är en lämplig kolonibildande enhet (CFU) räkning fortfarande krävs för noggrann kvantifiering av denna T6SS aktivitet.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på reagens / material </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> P. aeruginosa PAKΔ rets (D +) (Aktiva T6SS) </td><td> Lab stam </td><td></td><td> Beskrivs i Referens 16 </td></tr><tr><td> P. aeruginosa PAKΔ rets Δ H1-T6SS (D -) (inaktiva T6SS) </td><td> Denna studie </td><td></td><td> H1-T6SS kluster (som omfattar generna PA0070 till PA0095) har tagits bort av alleliskt utbyte enligt det förfarande som beskrivs i Referens 18. Den mutator fragmentet genererades med följande uppsättning primers: UPP-fragment primers: 5&#39;-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3 &#39;, och 5&#39;CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3 &#39;. De Down fragment primers: 5&#39;-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3 &#39;, <pre> 5&#39;-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3 &#39; </pre></td></tr><tr><td> E. coli DH5a </td><td> Invitrogen </td><td> 18258-012 </td><td> F-φ80 lac ZΔM15 Δ (lac ZYA-Arg F) U169 rec A1 slut A1 HSD R17 (r k - m k +) pho A sup E44 λ-thi -1 Gyr A96 rel A1 </td></tr><tr><td> pBluescript II SK (+) </td><td> Agilent </td><td> 212.205 </td><td> Denna vektor uttrycker α peptiden av β-galaktosidas användes för α-komplementering. </td></tr><tr><td> X-gal </td><td> Invitrogen </td><td> 15520-018 </td><td> Användning vid 40 | ig / ml </td></tr><tr><td> Luria Bertani agar </td><td> Merck-kemikalier </td><td> 1.10283.0500 </td><td></td></tr><tr><td> TSB (kasein sojaböna buljong) </td><td> Oxoid </td><td> CM109 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Virvelskakanordning Genius 3 </td><td> IKA </td><td> 3340000 </td><td></td></tr><tr><td> Skanner </td><td> Epson </td><td> V700 </td><td></td></tr><tr><td> Spektrofotometer </td><td> WPA Biowave </td><td> CO8000 celltäthet Meter </td><td></td></tr><tr><td> Magenta-gal </td><td> Bioworld </td><td> 30350001-1 (715241) </td><td></td></tr><tr><td> Röd-gal </td><td> Forskning organiska </td><td> 1364c </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabell 1. Stam, plasmiden, material och reagens som används. </td></tr></tbody></table>

a visual assay to monitor t6ss-mediated bacterial competition

Typ VI sekretionssystem (T6SSs) är molekylära nanomaskiner tillåter gramnegativa bakterier att transportera och injicera proteiner i en mängd olika målceller 1,2. Den T6SS består av 13 kärnkomponenter och visar strukturella likheter med svans-röret av bakteriofager 3. Fagen använder ett rör och en punktering anordning att penetrera cellhölje av målbakterier och injicera DNA. Det föreslås att T6SS är en inverterad bakteriofag anordning skapa en särskild väg i bakteriecellen kuvertet för att driva effektorer och gifter till ytan. Processen kan drivas vidare och T6SS enhet kan perforera andra celler som bakterien är i kontakt därmed injicerar effektorer i dessa mål. Svansen rör och punkteringspositioner delar anordning av T6SS görs med Hcp och VgrG proteiner, respektive 4,5. Mångsidigheten hos T6SS har visats genom studies med olika bakteriella patogener. Vibrio cholerae T6SS kan omforma cytoskelettet av eukaryota värdceller genom injektion av en &quot;evolved&quot; VgrG bär en C-terminal aktin tvärbindande domän 6,7. Ett annat slående exempel nyligen dokumenterats med Pseudomonas aeruginosa som kan rikta och döda bakterier i en T6SS-beroende sätt, därför främja upprättandet av bakterier inom specifika mikrobiella nischer och konkurrenskraftig miljö 8,9,10. I det senare fallet har tre T6SS-utsöndrade proteiner, nämligen Tse1, Tse2 och Tse3 identifierats som gifter injiceras i mål bakterier (figur 1). Donatorcellen skyddas från den skadliga effekten av dessa effektorer via en anti-toxin mekanism, förmedlad av Tsi1, Tsi2 och Tsi3 immunitet proteiner 8,9,10. Denna antimikrobiella aktivitet kan övervakas när T6SS-skickliga bakterier samodlas på sOlid ytor i konkurrens med andra bakteriearter eller T6SS-inaktiva bakterier av samma art 8,11,12,13. De uppgifter som finns tillgängliga betonade ett numeriskt sätt att den bakteriella konkurrens-analysen, inklusive tidskrävande CFU räknar som beror mycket på antibiotika beslutsfattare. I fallet av antibiotikaresistenta stammar som P. aeruginosa, kan dessa metoder vara olämplig. I och med identifieringen av cirka 200 olika T6SS loci i mer än 100 bakteriella genomen 14, är ett praktiskt screeningmetod mycket önskvärt. Vi utvecklade en analys som är lätt att använda och kräver standard laboratorie material och reagens. Metoden erbjuder en snabb och kvalitativ teknik för att övervaka T6SS-beroende baktericid / BAKTERIOSTAS aktivitet genom användning av en reporter-stam som en byte (i detta fall Escherichia coli DH5a) tillåter en-komplementering av lacZ-genen. Sammantaget är denna metod grapHIC och möjliggör snabb identifiering av T6SS-relaterade fenotyper på agarplattor. Denna experimentella protokoll kan anpassas till andra stammar eller bakteriella arter med hänsyn till specifika förhållanden såsom tillväxtmedier, temperatur eller tid av kontakt.

Typiska resultat visas i figur 1 med de stammar och reagens som beskrivs i tabell 1. Plattorna som visas i denna figur skannades efter inkubation över natten. De &quot;Avläsning-input&quot; plattor visar en seriell spädning mönster för de stammar som används i denna analys. Som väntat, E. E. coli bytesdjur fläckar (P) överuttrycker lacZ-genen visas blå på media kompletterade med X-gal, medan givaren P. aeruginosa-stammar (D +, T6SS aktiv) och (D -, T6SS inaktiv) förblir vitt. De &quot;Avläsning-output&quot;-plattor på vilka blandning mellan bytet och en T6SS aktiv stam (D + / P) har setts visar försvinnandet av den blå byten vilket indikerar att det har dödats. Detta visar förmåga givaren konkurrera ut bytet. Den ihållande den blå färgen på (D - / P) platta visar oförmåga en inaktiv T6SS givare för att döda den blå bytet. <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig1.jpg" alt="Figur 1"/> Figur 1. Dödande av E. E. coli genom T6SS-kunnig P. aeruginosa. P. aeruginosa sprutar gifter i E. E. coli målcell i en T6SS-beroende sätt (visas med den vita pilen). Två toxiner Tse1 och Tse3 (orange och röda cirklar) injiceras i E. E. coli periplasma och försämra peptidoglykanet 9. Den Tse2 toxinet (gul cirkel) injiceras in i E. E. coli cytoplasman och har en bakteriostatisk aktivitet 8,10. Den kombinerade effekten av gifter dödar målceller (blixt och skalle). Överlevnaden av målceller kan detekteras genom att övervaka aktiviteten av den framställda β-galaktosidas (se även figur 2). P. eneruginosa skyddas mot aktiviteten av de gifter från immunitet proteinerna Tsi1, Tsi2 och Tsi3 (orange, gula och röda rutor, respektive) 8,9,10. <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2.jpg" alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2highres.jpg"/> Figur 2. Agarplatta analysens T6SS-beroende bakteriedödande I denna figur visas på den övre delen av &quot;Avläsning-input&quot; plattor bestående av serieutspädningar av D -., D + och P indatacellerna. P indatacellerna är blå på grund av α-komplementering av lacZ-genen och sålunda producerade β-galaktosidas som klyver X-gal. I den nedre delen visas de &quot;Avläsning-Output&quot; plattor bestående av serieutspädningar av den bakteriella blandningen mellan en aktiv (D + / P) </strong&gt; eller en inaktiv (D - / P), T6SS donator P. aeruginosa stam med E. E. coli byte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50103/50103fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se större bild</a> . <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig3.jpg" alt="Figur 3"/> Figur 3. Kvantifiering av mordet på E. coli genom P. aeruginosa efter 5 timmars inkubation. Diagrammet visar CFU rösträkningen E. E. coli beskrivs i 3,4 steg. De resultat som presenteras här visar en 3-faldig skillnad mellan T6SS + och T6SS-stammarna, vilket tyder på att det mesta av dödandet sker under de 5 första timmarna av kontakt.

Watch this Scientific Journal Video about A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition at JoVE.com

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Vi beskriver en kvalitativ analys för att övervaka bakteriell konkurrens medieras av<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Typ VI sekretion system (T6SS). Analysen bygger på överlevnad / dödandet av Escherichia coli mål bär en<em&gt; LacZ</em&gt;-Reporter. Denna teknik är justerbar för att bedöma den baktericida / BAKTERIOSTAS aktivitet av T6SS-kompetenta mikroorganismer.

En visuell analys för att övervaka T6SS-medierad bakteriell konkurrens

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Använda luciferas till bild bakteriella infektioner hos möss

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated Peyer&#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Tillämpning av en mus knyts ihop Peyer s Patch Intestinal Loop-analys för att utvärdera Bakteriell Upptag av M celler

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Använda Overlay-analys för att Kvalitativt Mät Bakteriell Produktion av och känslighet för pneumokockinfektioner bakteriociner

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Parvis Tillväxt Konkurrens analys för att bestämma replikerings Fitness av humant immunbristvirus

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Tillämpning av Långsiktigt odlade Interferon-γ Enzymkopplad immunospot analys för bedömning Effector och Memory T-cellssvar hos nötkreatur

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation och multi fenotypisk Hög halt Screening av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutanter

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Upptäcka Cortex Fragment Under Bacterial sporgroning

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visuella och mikroskopiska utvärdering av Streptomyces utvecklingsmässiga mutanter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

En hög genomströmning Shigella-specifika bakteriedödande analysmetod

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Lägre dödande Assay att bedöma immunologiska reaktion mot bakteriella patogener

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...