Name: generation of topically transgenic rats by in utero electroporation and in vivo bioluminescence screening
Uploaded: 2013-09-24T11:45:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening at JoVE.com

Авторы выражают благодарность Трейси Янг-Пирс и Ацуши Камия за предоставление плазмиды. Эта работа финансировалась по Нейрон-Eranet обнаружить или и CK (BMBF 01EW1003), DFG (Ko 1679/3-1; GRK1033) к CK, и (DE 792/2-4) к массовым

<ol>
	<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).</li><li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortex+patterning+by+the+secreted+signaling+molecule+FGF8.">Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8.</a> Science. 294, 1071-1074 (2001).</li><li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Utero+Intraventricular+Injection+and+Electroporation+of+E16+Rat+Embryos.">In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).</li><li>Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+Electroporation+followed+by+Primary+Neuronal+Culture+for+Studying+Gene+Function+in+Subset+of+Cortical+Neurons.">In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons.</a> J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).</li><li>Takahashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos.">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70, 155 (2002).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li><li>Nakahira, E., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+generation,+migration,+and+differentiation+in+the+mouse+hippocampal+primoridium+as+revealed+by+enhanced+green+fluorescent+protein+gene+transfer+by+means+of+in+utero+electroporation.">Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation.</a> J Comp Neurol. 483, 329-340 (2005).</li><li>Young-Pearse, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+function+for+beta-amyloid+precursor+protein+in+neuronal+migration+revealed+by+in+utero+RNA+interference.">A critical function for beta-amyloid precursor protein in neuronal migration revealed by in utero RNA interference.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 27, 14459-14469 (2007).</li><li>Niwa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+DISC1+by+in+utero+gene+transfer+disturbs+postnatal+dopaminergic+maturation+in+the+frontal+cortex+and+leads+to+adult+behavioral+deficits.">Knockdown of DISC1 by in utero gene transfer disturbs postnatal dopaminergic maturation in the frontal cortex and leads to adult behavioral deficits.</a> Neuron. 65, 480-489 (2010).</li><li>Sapir, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+balance+of+the+polarity+kinase+MARK2/Par-1+is+required+for+proper+cortical+neuronal+migration.">Accurate balance of the polarity kinase MARK2/Par-1 is required for proper cortical neuronal migration.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 28, 5710-5720 (2008).</li><li>Weinberger, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+neuropathology+to+neurodevelopment.">From neuropathology to neurodevelopment.</a> Lancet. 346, 552-557 (1995).</li><li>Murray, R. M., Lewis, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+schizophrenia+a+neurodevelopmental+disorder?.">Is schizophrenia a neurodevelopmental disorder?.</a> British Medical Journal. 295, 681-682 (1987).</li><li>Kamiya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+schizophrenia-associated+mutation+of+DISC1+perturbs+cerebral+cortex+development.">A schizophrenia-associated mutation of DISC1 perturbs cerebral cortex development.</a> Nat Cell Biol. 7, 1167-1178 (2005).</li><li>Miyoshi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted-In-Schizophrenia+1,+a+candidate+gene+for+schizophrenia,+participates+in+neurite+outgrowth.">Disrupted-In-Schizophrenia 1, a candidate gene for schizophrenia, participates in neurite outgrowth.</a> Mol Psychiatry. 8, 685-694 (2003).</li><li>Mao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted+in+schizophrenia+1+regulates+neuronal+progenitor+proliferation+via+modulation+of+GSK3beta/beta-catenin+signaling.">Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation via modulation of GSK3beta/beta-catenin signaling.</a> Cell. 136, 1017-1031 (2009).</li><li>Millar, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+two+novel+genes+by+a+translocation+co-segregating+with+schizophrenia.">Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia.</a> Hum Mol Genet. 9, 1415-1423 (2000).</li><li>Steinecke, A., Gampe, C., Valkova, C., Kaether, C., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted-in-Schizophrenia+1+(DISC1)+is+necessary+for+the+correct+migration+of+cortical+interneurons.">Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) is necessary for the correct migration of cortical interneurons.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 738-745 (2012).</li><li>Niwa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+DISC1+by+in+utero+gene+transfer+disturbs+postnatal+dopaminergic+maturation+in+the+frontal+cortex+and+leads+to+adult+behavioral+deficits.">Knockdown of DISC1 by in utero gene transfer disturbs postnatal dopaminergic maturation in the frontal cortex and leads to adult behavioral deficits.</a> Neuron. 65, 480-489 (2010).</li><li>Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+electroporation+as+a+tool+for+genetic+manipulation+in+vivo+to+study+psychiatric+disorders:+from+genes+to+circuits+and+behaviors.">In utero electroporation as a tool for genetic manipulation in vivo to study psychiatric disorders: from genes to circuits and behaviors.</a> The Neuroscientist : a Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry 18. , 169-179 (2012).</li><li>Bai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+reveals+doublecortin+is+required+for+radial+migration+in+rat+neocortex.">RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex.</a> Nat Neurosci. 6, 1277-1283 (2003).</li><li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li><li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+gene+expression+in+chick+embryos+by+microelectroporation.">Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 41, 335-344 (1999).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19, 120-125 (2009).</li><li>Featherstone, R. E., Kapur, S., Fletcher, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amphetamine-induced+sensitized+state+as+a+model+of+schizophrenia.">The amphetamine-induced sensitized state as a model of schizophrenia.</a> Progress in Neuro-psychopharmacology &amp; Biological Psychiatry. 31, 1556-1571 (2007).</li><li>Pum, M., Carey, R. J., Huston, J. P., Muller, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociating+effects+of+cocaine+and+d-amphetamine+on+dopamine+and+serotonin+in+the+perirhinal,+entorhinal,+and+prefrontal+cortex+of+freely+moving+rats.">Dissociating effects of cocaine and d-amphetamine on dopamine and serotonin in the perirhinal, entorhinal, and prefrontal cortex of freely moving rats.</a> Psychopharmacology. 193, 375-390 (2007).</li><li>dal Maschio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe.">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nature Communications. 3, 960 (2012).</li></ol>

Авторы этого исследования не имеют финансовый интерес в этом исследовании и не были авторами промышленности для данного исследования. Сборы открытого доступа были предоставлены сообщению издания PerkinElmer Инк.

В нашем исследовании показано, что МСЭ подходит для генерации взрослых крыс с нейроны экспрессирующие трансген в селективной области мозга, и что в результате этого вмешательства, эти животные обладают изменений в поведении, указывающий функциональность выполненной манипуляции. В этом исследовании, в качестве примера, крысы сверхэкспрессирующие DISC1 в одностороннем порядке в небольшой части префронтальной коры показали гиперчувствительность к амфетамина (рис. 9). Выбор крыс для электропорации успехом в естественных условиях биолюминесценции изображений было эффективным в борьбе присущего изменчивости ИЭГ трансфекции клеток и был применен для создания группы с однородным ИЭГ области низкого межпредметных изменчивости для дальнейших исследований. В этом исследовании, мы не смогли выбрать электропорации щенков из помета путем выявления со-электропорации GFP-индуцированной флуоресценции в новорожденного животного, даже хотяУф в то же время и в том же животного биолюминесценции сигнала одинаково со-электропорации люциферазы могут быть обнаружены после инъекции люциферин (рис. 6), и GFP выражения нейронов были все еще ​​присутствует в головном мозге в возрасте шести месяцев. Мы пришли к выводу, что, у крыс, реакция люциферазы / люциферина хорошо подходит для дифференциации животных с успешными электропорации мозгов (рис. 3). Количественный контроль ИЭГ успеха относится к мощности сигнала биолюминесценции, которая измеряется по пунктам фотонов в то же время экспозиции (рис. 3) и соответствует ферментативной активности совместной экспрессии люциферазы. Слабые сигналы биолюминесценции обнаруживаются на 100-200 пунктам фотонов, и, в сиянии ~ 1x10 4 фотон / сек / см 2 / стерадиан шоу 1000-2000 GFP-окрашенных клеток в гистологии в 6 месяцев мозга крысы. Самый высокий сигнал DISPзаложен в сияние до ~ 5x10 6 фотон / сек / см 2 / стерадиан и ~ 64000 пунктам. В линии крыс Спрэг Dawley используется, мы наблюдали ослабление сигнала биолюминесценции продольно с увеличением возраста и сигнал исчез в возрасте старше P35 (рис. 4). На данный момент, мы не знаем, уменьшает ли либо временными, плазмиды вектор на основе экспрессии люциферазы, или если сигнал биолюминесценции ослабляет связи с увеличением массы мозга, или обоих причины для сигнала исчезает. Для настоящего функциональном анализе в взрослых крыс, выбор для поведенческих исследований было сделано только на основе расположения сигнала, но не силой биолюминесценции сигнала. Несмотря на то, мониторинг 3D количественный биолюминесценции разрешено дифференциация между различными электропорации областях (рис. 5), его точность была ограничена для клеток, расположенных в глубине десяти центовnsion мозга. 6 показан пример гиппокампа электропорации, когда измерение биолюминесценции в 2D и 3D изображения, указанного хорошую позиционирование электропорации. В рассеченной посмертного мозга, сигнал флуоресценции GFP-был обнаружен примерно в той же позиции, что и сигнал биолюминесценции, что указывает на правильный нацеливание гиппокампа. Но гистологии показывает, что также клетки в коре головного мозга спинной гиппокампа были направлены (рис. 7). Это означает, что биолюминесценции анализа является полезным инструментом для выявления положительных ИЭГ щенков, а также иметь представление о электропорации области, но, в конечном счете, работы с изображениями не могут заменить посмертного гистологию точно локализовать положительно клетки-мишени. Наша демонстрация показывает перспективы для применения ИЭГ технологии, чтобы генерировать тонкие целенаправленные манипуляции корковых или гиппокампа областях мозга для имитации aberrances в сortical миграция или другие дефекты развития нервной системы, которые могут повлиять на взрослого животного. В то время как двусторонние электропорации 26 имеет преимущество всего большее влияние на поведение, есть и еще смертности эмбрионов. Одностороннее электропорации был выбран для того, чтобы сравнить два полушария с одним в качестве внутреннего контроля, а также для демонстрации, что даже ИЭГ манипулирования в одностороннем, небольшой области достаточно, чтобы изменить поведение. ИЭГ-индуцированные изменения в связи или архитектуры между нейронами могут, таким образом быть вызваны не вызывая поражение и необходимое матч к-быть-ИЭГ-манипулировать области с соответствующим поведенческим теста зависит от научного вопроса. Поиск и устранение неисправностей Уменьшение размера помета Есть несколько предложений относительно повышения выживание ИЭГ щенков. Во-первых, использование очень тонких стеклянных капилляров в течение электропорации, с тем чтобы свести к минимуму ткани lesioн рекомендуется. Во-вторых, не электропорации первый эмбрион в вагинальной конце каждого матки рога: смерть первенца эмбриона повышает шансы на прерывания всех других эмбрионов. В-третьих, после рождения, мать крысы часто убивают часть их потомства из-за перинатальной стресса. Для того чтобы уменьшить дополнительную нагрузку, не начинайте с живого изображения сразу после рождения, но ждать в течение семи дней. Обнаружение GFP-флуоресценция щенков Через неделю после рождения, нет сигнала флуоресценции либо с помощью живой бинокулярное флуоресценции микроскопических изображений или изображений флуоресценции с IVIS Spectrum (эпифлуоресцентной и transfluorescence режимов; для возбуждения GFP / эмиссии: 465/520 нм и 500/540 нм). Вполне возможно, что оба, ограниченный передачи коротких длин волн возбуждения и излучения света через ткань как черепа и высокого фона автофлуоресцентной кожи предотвратить с помощью флуоресценции под алфавитуribed условия на крысах. Как показано на фиг.6, люциферазы сигнала в живом организме также могут быть обнаружены в головном мозге расчлененным (без черепа) и там, также сигнал флуоресценции обнаруживается (рис. 6D). Дифференциация биолюминесценции в близко расположенных областях мозга Даже в 3D иллюстрации расположение области биолюминесценции не могут быть предсказаны на 100%. Особенно клетки в верхней части или ниже предсказанной области также может быть случайно мишенью и трансфецируют. Точное положение должно быть под контролем Post Mortem (флуоресценция) гистологии (см. рисунок 7).

Развитие электропорации внутриутробно метода (ИЭГ), которая позволяет модуляцию экспрессии генов в развивающемся мозге, был прорыв, поскольку он включен изучения развитие нервной системы с относительной легкостью. 1-7 Изменения в уровнях экспрессии гена-мишени в конкретный отдел головного мозга во время эмбрионального и / или перинатальной развития у грызунов были продемонстрированы критически влияние нейронов пролиферацию, миграцию, разветвление и подключение. 8-10 Шизофрения является сложным психическим заболеванием с острыми и хроническими симптомами, которые были, связанных с развитием нервной системы аномалий 11, 12 и, следовательно, многие из выявленных генов-кандидатов для шизофрении исследуются Возможное воздействие на модулирующих на развитие нервной системы, как, например, для нарушается-в-шизофрении -1 (DISC1) гена 13-15. Развитие мозга является регулиред генетическими факторами и их взаимодействия с окружающей средой, которые играют роль в пре-, пери-и постнатальный периоды развития. Одним из основных факторов генетического риска для различных поведенческих расстройств является DISC1 16 ген. DISC1 нокдаун приводит к миграции дефектов в мышах 13, 17, и манипулирование DISC1 выражения в развивающихся коры по ИЭГ было показано, что влияние поведение мышей взрослых 18. Манипулирование экспрессию генов мозга на МСЭ имеет ряд преимуществ 19 по генерации трансгенных линий животных. Во-первых, экспрессия гена в областях, представляющих интерес достигается в течение нескольких недель до нескольких месяцев, а не нескольких поколений разведения трансгенных линий грызунов. Во-вторых, компенсаторные механизмы на ранних стадиях развития, которые могут оградить фенотипы в зародышевой линии инженерии животных 20 можно избежать. В-третьих, через ориентация только конкретный население клеток или определенную область мозга, migratiили различия распространения можно напрямую сравнивать с не-мутанта или контролировать противоположной стороне, если односторонние electroporations выбраны. С другой стороны, МСЭ не имеет точность промотора приводом CRE / LOX-индуцированной экспрессии времени и только субпопуляции клеток в определенной области целевой ведет к мозаичного вида паттерна экспрессии генов. Для многих применений в экспериментальных взрослых грызунов, кратковременной трансфекции ограниченного числа клеток в области мозга может быть недостаточно, или даже желательно, так что основным преимуществом стабильных, зародышевой линии трансгенных грызунов-незначительна. На самом деле, ИЭГ полезно исследовать ли некоторые аномально развитые клетки могут повлиять целую сеть ячеек или схемы. Еще одно преимущество может быть способность демонстрировать не являющихся клеточно-автономной эффекты гена связано с мозаичным характером хит. Кроме того, поколение трансгенных и нокаут крыс все еще находится в зачаточном состоянии и использованиеиз ИЭГ у этого вида для изучения аномальным последствия развития мозга представляет большой интерес. До сих пор основным препятствием использования ИЭГ для исследования последствий вмешательства в тех животных, что и взрослые, является отсутствие успеха мониторинг электропорации. До сих пор GFP-котрансфицируют флуоресцентные нейронов в живых новорожденных детенышей крыс не могли быть обнаружены при подходящем бинокулярного флуоресцентного микроскопа или с флуоресцентной визуализации с IVIS Spectrum. Чтобы преодолеть это препятствие, мы котрансфицируют люциферазы ген-репортер и выполняется биолюминесценции Живая съемка щенков от 3-х мерные (3D) количественным определением ИЭГ области мозга. В качестве примера для демонстрации применимости этого метода в более поздней функциональном анализе тестирования развития нервной системы генетические манипуляции, cо-инъекцию плазмиды, содержащие человеческую DISC1, люциферазу и GFP в боковой желудочек эмбрионов крыс <suр&gt; 3 с последующим электропорации с пинцета электрода была выполнена. В то время как флуоресцентные сигналы не могли быть обнаружены в постнатальном этапах в естественных условиях, твердый биолюминесценции сигнал получают из люциферин метаболизма путем совместной трансфекции гена люциферазы детектировали до пяти недель после рождения. 3D-измерения электропорации области мозга позволило количественного которой щенки с недостаточным или неуместной электропорации были определены с самого начала, тем самым, позволяя назначение ИЭГ животных (генных интерес и яичницы контроль) в экспериментальных группах с согласованными электропорации областях мозга низкой изменчивости . Использование взрослых крыс ИЭГ в поведенческих парадигм была продемонстрирована в качестве примера полезности этого протокола.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent name</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>without calcium, without magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin, sodium salt</td>
			<td>SynChem OHG, Germany</td>
			<td>BC218</td>
			<td>CAS number: 103404-75-7 substrate for firefly-luciferase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>CAS: 2353-45-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Amphetamine</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>A 5880</td>
			<td>CAS: 51-63-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kodan Tinktur forte</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH, Germany</td>
			<td>104 005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material / product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Novato, California, USA</td>
			<td>borosilicate glass O.D.:1 mm, I.D.: 0.78 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Tujunga, California, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrode</td>
			<td>Nepa Gene CO., LTD.</td>
			<td>Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan</td>
			<td>7 mm in diameter platinum disc electrodes (<a href="http://www.sonidel.com/product_info.php?products_id=129" target="_blank">CUY650P7</a>)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Heidelberg, Germany</td>
			<td>Straight, 12 cm (14002-12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Heidelberg, Germany</td>
			<td>2.2 mm ID, 3 mm OD (11021-12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wave pulse electroporator (CUY21SC)</td>
			<td>Nepa Gene CO., LTD.</td>
			<td>Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan</td>
			<td>(CUY21SC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl surgical suture material</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Norderstedt, Germany</td>
			<td>3-0; 2 Ph. Eur;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound Clip Applicator</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Heidelberg, Germany</td>
			<td>Reflex 9 mm (12032-09)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Darmstadt, Germany</td>
			<td>0.45 &#956;m cellulose acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum</td>
			<td>Caliper Life Science / PerkinElmer</td>
			<td>Waltham, MassachusettsUSA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI-8 Gas Anesthesia System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Waltham, Massachuset tsUSA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-field</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td>Allentown, USA</td>
			<td>(40 x 40 x 39 cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tru Scan activity system</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td>Allentown, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<table border="1">
				<tbody>
					<tr>
						<td colspan="4">Table of recipes</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Number</td>
						<td>Buffer name</td>
						<td>Content</td>
						<td>Comments </td>
					</tr>
					<tr>
						<td>1</td>
						<td>DNA-Mixture for DISC-1 overexpressing</td>
						<td>1.5 &#956;g/&#956;l pCAX humanDISC-1, 
						0.5 &#956;g/&#956;l pCAX-luciferase, 
						10x PBS (10%) Fast Green Dye (0.5%) add H2O</td>
						<td>100 &#956;l of the mixture are enough for ~5 IUE</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>2</td>
						<td>DNA-Mixure for control</td>
						<td>0,75 &#956;g/&#956;l control shRNA1, 0,75 &#956;g/&#956;l control shRNA2, 0.5 &#956;g/&#956;l pCAX-luciferase, 0.5 &#956;g/&#956;l pCAGGS-GFP 10x PBS (10%) Fast Green Dye (0.5%) add H2O</td>
						<td>100 &#956;l of the mixure are enough for ~5 IUE</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>3</td>
						<td>Fast green Dye</td>
						<td>10 mg/ml Fast Green FCF in ddH2O</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>4</td>
						<td>D-luciferin solution</td>
						<td>15 mg/ml D-luciferin, sodium salt in PBS</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>5</td>
						<td>Amphetamine solution</td>
						<td>0.5 mg/ml D-Amphetamine in PBS</td>
						<td></td>
					</tr>
				</tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of topically transgenic rats by in utero electroporation and in vivo bioluminescence screening

Внутриутробное электропорации (ИЭГ) представляет собой метод, который позволяет генетической модификации клеток в головном мозге за расследование нейронов развития. До сих пор использование ИЭГ для исследования поведения или невропатологии в взрослом мозге была ограничена недостаточным методов мониторинга ИЭГ успеха трансфекции по неинвазивных методов в послеродовых животных. Для настоящего исследования, E16 крысы были использованы для МСЭ. После внутрижелудочкового введения нуклеиновых кислот в эмбрионах, позиционирование пинцета электродов имеет решающее значение для ориентации либо развивающуюся кору или гиппокамп. Желудочков со впрыском и электропорации гена люциферазы позволило мониторинга трансфицированных клеток постнатально после внутрибрюшинного введения люциферин в наркозом жить P7 щенка по в естественных условиях биолюминесценции, используя устройство IVIS Spectrum с 3D программного обеспечения количественного. <pкласс = &quot;jove_content&quot;&gt; Определение Площадь по биолюминесценции мог ясно различать корковых и гиппокампа electroporations и обнаружить сигнал продольно в течение долгого времени до 5 недель после рождения. Этот метод визуализации позволили выбрать щенков с достаточным количеством трансфицированных клеток, взятых необходимо для инициирования биологических эффектов и, соответственно, для выполнения поведенческих исследований на 3-месячного возраста. В качестве примера, это исследование показывает, что ИЭГ с полной длины гена DISC1 человека в крысиной коры привели к амфетамина гиперчувствительности. Котрансфицируют GFP могут быть обнаружены в нейронах по Post Mortem флуоресцентной микроскопии в криосрезов указанием экспрессию гена присутствующую в ≥ 6 месяцев после рождения. Мы пришли к выводу, что послеродовая изображений биолюминесценции позволяет оценить успех временных трансфекций с ИЭГ у крыс. Исследования по влиянию актуальных генных манипуляций во время neurodevelopmenт на взрослом мозге и его соединения являются значительно облегчается. Для многих научных вопросов, эта техника может дополнить или даже заменить использование трансгенных крыс и обеспечивают технологии нового для поведенческой неврологии.

<html> Фигура 3 показывает жить измерения изображений трех крысят в Р7 после инъекции 150 мг люциферин / кг массы тела. Различия силы сигнала, указывающие на изменчивость в эффективности МСЭ видны. Сильные сигналы биолюминесценции зафиксировано не было, пока P36 (рис. 4). На рисунке 5, способность определить корковой (5А и 5С) и гиппокампа (рис. 5B и 5D) электропорации по визуализации биолюминесценции изображены. Корреляция биолюминесценции сигнала (фиг.7а) с его сигнала флуоресценции после удаления черепа (фиг.7В) и соответствующий GFP-электропорации клеток в cryosectioned мозга (рис. 8) на P14 изображены на рисунках 6-8. Следует отметить, что не было никакого обнаружение сигнала флуоресценции в живых крыс в любой момент времени. палатка &quot;&gt; В естественных изображений биолюминесценции позволяет приблизительное дискриминации различных областей мозга электропорации по 2D (фиг. 5A и 5B), который значительно улучшилась с DLIT программы программного обеспечения IVIS спектра генерации изображений 3D (фиг. 5С и 5D). В показанных примерах , электропорацию префронтальной коры и гиппокампа можно выделить. Следует отметить, что в то время как с целью электропорации гиппокамп, некоторые клетки-предшественники для коры лежащий спинного гиппокампа также может быть удар (рис. 7). Крысы в одностороннем порядке в период внутриутробного развития электропорированные с pCAX вектора в кору, а затем сверхэкспрессирующие длина полного человеческого DISC1 были исследованы как спонтанного, так и амфетамином гиперактивности, как взрослые. Крысы электропорированные с pCAX-DISC1 были гиперчувствительностью к низкой дозой амфетамина. Эти крысы значительно переехал месповторно после амфетамина лечения, чем после инъекции физиологического раствора, в то время как контрольные животные не было (рис. 10). <img alt="Рисунок 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig1.jpg" /> Рисунок 1. Схема положении электрода для A) кора электропорации и В) гиппокампа электропорации, зеленый = вводили ДНК-Mix в желудочек. <img alt="Рисунок 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig2.jpg" /> Рисунок 2. Люциферазную реакция. <img alt="Рисунок 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig3.jpg" /> Рисунок 3. Измерение люминесценции P7 крыс после инъекции 150 мг / кг массы тела люциферин; время экспозиции 180 сек; A) крыса, не люминесценции сигнала; B) крыса<html> со слабым биолюминесценции сигнала; C) крыса с сильным сигналом люминесценции. <img alt="Рисунок 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig4.jpg" /> Рисунок 4. Время линия последовательных измерений биолюминесценции того же крысы после инъекции 150 мг / кг люциферина демонстрируя большое окно времени, где ИЭГ успех может быть обнаружена. <img alt="Рисунок 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig5.jpg" /> . Рисунок 5 Иллюстрация различий между корковой и гиппокампа электропорации в P7 А) и Б) 2D картинки;. C) и D) 3D изображений: а) &amp; C) из коры, б) и г) от гиппокампа.files/ftp_upload/50146/50146fig5highres.jpg &quot;&gt; Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок. <img alt="Рисунок 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig6.jpg" /> Рисунок 6. Иллюстрация E16 гиппокампа электропорации крысы щенка на P14 А) 2D-изображения биолюминесценции B) 3D иллюстрации биолюминесценции сигнала C) расчлененный мозг с биолюминесценции сигнала D) головного мозга с GFP эпи-сигнала флуоресценции. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146fig6large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок</a> . <img alt="Рисунок 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig7.jpg" /> Рисунок 7. Деталь флуоресценции изображение с крио разделе 20 мкм того же P14 мозга крысы электропорации с GFP, содержащий плазмиды и люциферазывектор, ядра окрашивание DAPI; АК1-3 = Корню Ammonis 1-3; DG = зубчатой ​​извилине; FC = Fasciolarum серое вещество. Видео 1. 3D анимация гиппокампа электропорации крысу на P14. <img alt="Рисунок 8" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig8.jpg" /> Рисунок 8. Амфетамин испытания схема: первый день инъекции физиологического раствора до 15 мин судебного разбирательства, 24 часа в сутки позже амфетамин впрыска до тестирования в открытом поле камеры. <img alt="Рисунок 9" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig9.jpg" /> Рисунок 9. Амфетамин испытания. Бар график, показывающий перемещенный расстояние (в см) животного, записанные с помощью TrueScan системы в течение 15 мин белые полосы = контрольной группе;. Серые полосы = DISC1 гиперэкспрессией группа; контрольная группа п = 10; DISC1 избыточная экспрессия группа п = 11; ANOVA: генотип * лечение р = 0,043; Т-тест для общего времени физиологическим раствором против амфетамина нс = не имеет значения PControl = 0,172, pDISC1 = 0,001.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening at JoVE.com

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Гены можно манипулировать во время развития мозга или гиппокампа крысы через внутриутробно электропорации (ИЭГ) на E16, для того, чтобы быстро и целевые изменения в нейронной связи для более поздних исследованиях поведения или невропатологии у взрослых животных. Послеродовая в естественных изображений для управления ИЭГ успеха осуществляется биолюминесценции активации котрансфицируют люциферазу.

Генерация Тематически трансгенных крыс<em&gt; В утробе матери</em&gt; Электропорацию и<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Биолюминесценция Скрининг

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

Внутриутробное Электропорация последующей первичной нейронов культуры для изучения функции генов в Подмножество корковых нейронов

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Трансфекция Мышь ганглиозных клеток сетчатки при В естественных условиях Электропорация

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Эффективное доставки генов в нескольких территориях ЦНС Использование In Utero Электропорация

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Мышь В утробе матери Электропорация: Пространственно-временные Контролируемые трансфекции генов

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Функциональные нейровизуализации с использованием ультразвуковых Гематоэнцефалический Разрушение барьеров и марганца-МРТ

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Расширение эмбриональных и взрослых нервных стволовых клеток путем<em&gt; В Utero</em&gt; Электропорации или вирусных Стереотаксическая инъекций

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Визуализация и генетических манипуляций дендритов и шипы в мышь коры головного мозга и гиппокамп использования<em&gt; Внутриутробное</em&gt; Электропорация

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Генетических манипуляций мышью Разработка Гипоталамус через<em&gt; В утробе матери</em&gt; Электропорацию

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Одновременный<em&gt; Экс естественных условиях</em&gt; Функциональное тестирование двух сетчатки по<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Система электроретинограммы

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

Биолюминесценция Визуализация нейровоспаления у трансгенных мышей после инокуляции периферической альфа-синуклеина фибрилл

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...