Name: identification of sleeping beauty transposon insertions in solid tumors using linker-mediated pcr
Uploaded: 2013-02-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לMoriarity Branden, הדוד Largaespada, ווינסנט Keng באוניברסיטת מינסוטה, והאדם Dupuy באוניברסיטה איווה על סיועם בפיתוח הפרוטוקול שתואר לעיל.

1. גידול והזדקנות של בעלי חיים מהונדסים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הזנים של עכברים מתאימים לניסוי שלך מהונדסים. ניסוי טיפוסי יהיה להשתמש בשלושה קווים מהונדסים; עכבר מותנה transposase, עכבר מחסה concatamer של transposons, ועכבר מבטא Cre recombinase בתאים שס?...

<ol>
	<li>Fearon, E. R., Vogelstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+model+for+colorectal+tumorigenesis.">A genetic model for colorectal tumorigenesis.</a> Cell. 61, 759-767 (1990).</li><li>Wood, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genomic+Landscapes+of+Human+Breast+and+Colorectal+Cancers.">The Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers.</a> Science. 318, 1108-1113 (2007).</li><li>Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsv&#225;k, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Reconstruction+of+Sleeping+Beauty,+a+Tc1-like+Transposon+from+Fish,+and+Its+Transposition+in+Human+Cells.">Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells.</a> Cell. 91, 501-510 (1997).</li><li>Starr, T. K., Largaespada, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+gene+discovery+using+the+Sleeping+Beauty+transposon.">Cancer gene discovery using the Sleeping Beauty transposon.</a> Cell Cycle. 4, 1744-1748 (2005).</li><li>Mueller, P. R., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Footprinting+of+a+Muscle+Specific+Enhancer+by+Ligation+Mediated+PCR.">In Vivo Footprinting of a Muscle Specific Enhancer by Ligation Mediated PCR.</a> Science. 246, 780-786 (1989).</li><li>Bergemann, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+methods+for+finding+common+insertion+sites+and+co-occurring+common+insertion+sites+in+transposon-+and+virus-based+genetic+screens.">New methods for finding common insertion sites and co-occurring common insertion sites in transposon- and virus-based genetic screens.</a> Nucleic acids research. 40, 3822-3833 (2012).</li><li>Copeland, N. G., Jenkins, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+transposons+for+cancer+gene+discovery.">Harnessing transposons for cancer gene discovery.</a> Nature Reviews Cancer. 10, 696-706 (2010).</li><li>Collier, L. S., Carlson, C. M., Ravimohan, S., Dupuy, A. J., Largaespada, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+gene+discovery+in+solid+tumours+using+transposon-based+somatic+mutagenesis+in+the+mouse.">Cancer gene discovery in solid tumours using transposon-based somatic mutagenesis in the mouse.</a> Nature. 436, 272-276 (2005).</li><li>Starr, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon-based+genetic+screen+in+mice+identifies+genes+altered+in+colorectal+cancer.">A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer.</a> Science. 323, 1747-1750 (2009).</li><li>Keng, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+transposon-based+insertional+mutagenesis+screen+for+genes+associated+with+mouse+hepatocellular+carcinoma.">A conditional transposon-based insertional mutagenesis screen for genes associated with mouse hepatocellular carcinoma.</a> Nature. 27, 264-274 (2009).</li><li>Dupuy, A. J., Akagi, K., Largaespada, D. A., Copeland, N. G., Jenkins, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+mutagenesis+using+a+highly+mobile+somatic+Sleeping+Beauty+transposon+system.">Mammalian mutagenesis using a highly mobile somatic Sleeping Beauty transposon system.</a> Nature. 436, 221-226 (2005).</li></ol>

מסך קדימה גנטי באמצעות המערכה היפיפייה הנרדמת transposon מספק שיטה לזיהוי מוטציות הגורמת לסרטן. על ידי בחירת האמרגן המתאים לשלוט Cre recombinase בנוסף לכל מוטציות predisposing, מסך SB יזהה ידוע וגנים סרטניים מועמד חדש. ההצלחה של מסך SB היא ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> לשכת אינדוקציה-חותם בטוח </td><td> מוח מדעי עץ </td><td> EZ-177 </td><td></td></tr><tr><td> Cryovial </td><td> Bioexpress </td><td> C-3355-2 </td><td></td></tr><tr><td> 10% Buffered פורמלין </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> HT501128-4L </td><td></td></tr><tr><td> פתרון רטיבות חלבון </td><td> Qiagen </td><td> 158910 </td><td></td></tr><tr><td> חיץ תמוגה תא </td><td> Qiagen </td><td> 158906 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Qiagen </td><td> 158920 </td><td></td></tr><tr><td> RNase </td><td> Qiagen </td><td> 158924 </td><td></td></tr><tr><td> TE המאגר </td> &lt;td&gt; Promega </td><td> V6232 </td><td></td></tr><tr><td> BfaI </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> R0568S </td><td></td></tr><tr><td> NlaIII </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> R0125S </td><td></td></tr><tr><td> MinElute 96 גם צלחות </td><td> Qiagen </td><td> 28051 </td><td></td></tr><tr><td> סעפת אבק QIAvac 96 </td><td> Qiagen </td><td> 19504 </td><td></td></tr><tr><td> Multi-microplate Genie, 120V </td><td> תעשיות מדע, בע&quot;מ </td><td> SI-4000 </td><td></td></tr><tr><td> ligase DNA T4 עם מאגר הקשירה 5x </td><td> Invitrogen </td><td> 15224-041 </td><td></td></tr><tr><td> BamHI </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> R0136S </td><td></td></tr><tr><td> dNTPs 25mm </td><td> Bioexpress </td><td> C-5014-200 </td><td></td></tr><tr><td> Taq פלטינום </td><td> Invitrogen </td><td&gt; 10966-034 </td><td></td></tr><tr><td> DNA פולימראז תקי FastStart </td><td> רוש </td><td> 12032929001 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Promega </td><td> V3121 </td><td></td></tr><tr><td> TAE המאגר </td><td> Promega </td><td> V4271 </td><td></td></tr><tr><td> TE המאגר </td><td> Promega </td><td> V6232 </td><td></td></tr><tr><td> Ethidium רומיד </td><td> Promega </td><td> H5041 </td><td></td></tr></tbody></table>

identification of sleeping beauty transposon insertions in solid tumors using linker-mediated pcr

ניתוח גנומי, proteomic, transcriptomic, וepigenomic של גידולים אנושיים מצביע על כך שיש אלף חריגות בתוך כל הגנום סרטן בהשוואה לרקמות מתאימות. בהתבסס על ניתוחים אלו ניתן לראות כי יש הרבה נהגים גנטיים ידועים של הסרטן 1. למרבה צער הנהגים האלה חבויים בתוך מספר גדול בהרבה של אנומליות נוסע בגנום שלא תורם באופן ישיר להיווצרות גידול. היבט נוסף של הגנום של הסרטן הוא שקיימת הטרוגניות גנטית ניכרה בתוך סוגי גידולים דומים. כל גידול יכול נמל מוטציות שונות המעניקות יתרון סלקטיבי להיווצרות גידול 2. ביצוע מסך גנטי קדימה משוחד בעכברים מספק את הכלים ליצירת גידולים ולנתח ההרכב הגנטי שלהם, תוך הפחתת רקע המוטציות נוסעות. היפיפייה נרדמת המערכת (SB) transposon היא שיטה אחת כזאת 3. המערכת מנצלת SB הנייד vectors (transposons) שניתן להוסיף לאורך הגנום על ידי אנזים transposase. מוטציות מוגבלות לסוג תא מסוים באמצעות שימוש באלל transposase המותנה שמופעל על ידי Cre recombinase. קווי עכבר רבים קיימים שrecombinase המפורש Cre ברקמות ספציפיות. על ידי חצייה אחד מהקווים הללו לאלל transposase המותנה (למשל קס-stop-קס-SB11), מערכת SB מופעלת רק בתאים שמבטאים Cre recombinase. Cre recombinase יהיה בלו קלטת תחנה שחוסמת ביטוי של אלל transposase, הפעלת mutagenesis transposon בתוך סוג התא המיועד לכך. מסך SB הוא שיזם רביית שלושה זנים של עכברים מהונדסים כך שעכברי הניסוי לשאת אלל מותנה transposase, concatamer של transposons, ואלל recombinase Cre רקמות ספציפיות. עכברים אלה אפשרו לגיל ועד צורת גידולים והם הופכים גוססים. העכברים הם אזהדנ&quot;א הגנומי necropsied ומבודד מהגידולים. בשלב הבא, הדנ&quot;א הגנומי נתונת המקשר בתיווך-PCR (LM-PCR) כי תוצאות בהגברה של לוקוסים הגנומי המכילים SB transposon. LM-PCR בוצע על גידול חד יגרום למאה amplicons השונה המייצג את מאה לוקוסים הגנומי המכילים הוספות transposon ב4 גידול יחידים. הוספות transposon בכל הגידולים מנותחות ואתרי החדרה נפוצים (CISS) מזוהים באמצעות שיטה סטטיסטית מתאימה 5. הגנים בתוך חבר העמים הם סבירים מאוד להיות אונקוגנים או גני מדכאי סרטן, והם נחשבים לגנים סרטניים מועמד. היתרונות של שימוש במערכת SB לזיהוי גנים סרטניים מועמדים הם: 1) transposon יכול בקלות להיות ממוקם בגנום בגלל הרצף שלו ידוע, 2) טרנספוזיציה יכולה להיות מופנה לכמעט כל סוג תא ו3) transposon מסוגל מציג גם רווח והפסד מוטציות-of-פונקצית 6. Following הפרוטוקול מתאר כיצד לתכנן ולהוציא לפועל מסך קדימה גנטי באמצעות מערכת transposon SB לזיהוי גנים סרטניים מועמד (איור 1).

לאחר תכנית הרבייה כבר נקבע, מגדלים צריכים לייצר המלטה כל 19-21 ימים. גודל המלטה משתנה בין 5 ל 12 גורים, בהתאם לגילו של המגדלים והרקע הגנטי. בנוסף, ודא שהגנוטיפ של ההמלטה כדלקמן גנטיקה המנדלית כדרך לאשר כי תכנית הרבייה היא גם נכונה ומוצלחת. <p class="jove_content" style=";text-align:right;direction...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR at JoVE.com

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

שיטה של ​​זיהוי נהגים לא ידועים של היווצרות הסרטן באמצעות גישה משוחדת מתוארת. השיטה משתמשת<em&gt; יפהפה נרדם</em&gt; Transposon כmutagen אקראי המכוונת לרקמות ספציפיות. מיפוי הגנום של הוספות transposon המניעות את היווצרות גידול מזהה אונקוגנים רומן וגני מדכאי סרטן

זיהוי<em&gt; יפהפה נרדם</em&gt; הוספות Transposon בגידולים מוצקים באמצעות PCR לינקר בתיווך

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

הקמה התפשטות של גידולים רטינובלסטומה האדם עכברים החיסון לקויה

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

הערכה של ספיגת nanoparticle ב גידולים בזמן אמת באמצעות הדמיה Intravital

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

הטרוגניות מיפוי של ביטוי חלבון בתוך גידולים באמצעות immunofluorescence כמותי

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

MicroRNA איתור גידולים הערמונית ב כמותי בזמן אמת PCR (QPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

בתרבות Organoid מבחנה של גידולים במעי גס עכבר העיקרי

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

נוזל עמוד שדרת MicroRNA פרופיל שימוש כמותי בזמן אמת PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

בדימות אופטי Vivo של גידולים במוח ודלקת פרקים באמצעות פלורסנט SapC-DOPS nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

Mass כמותי spectrometric פרופיל של Proteomes סרטן התאים נגזרים מנוזלים וגידולים מוצקים

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Spatial Measurements of Perfusion, Interstitial Fluid Pressure and Liposomes Accumulation in Solid Tumors

מדידות מרחבים של זלוף, לחצו נוזלי ביניים ו ליפוזומים צבירה בגידולים מוצקים

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes is a critical determinant of their efficacy. Both the chaotic tumor microcirculation and ...

Multicolor 3D Printing of Complex Intracranial Tumors in Neurosurgery

Multicolor 3D הדפסה של גידולים בתוך-גולגולתי מורכב בנוירוכירורגיה

Three-dimensional (3D) printing technologies offer the possibility of visualizing patient-specific pathologies in a physical model of correct dimensions. ...