Name: optogenetic activation of zebrafish somatosensory neurons using chef-tdtomato
Uploaded: 2013-01-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato at JoVE.com

Vi takker Fumi Kubo, Tod Thiele og HerwigBaier (UCSF / Max Planck Institute) for rådgivning om adfærd eksperimenter og DPSS laser iværksat; Heesoo Kim og Chiara Cerri fra MBL Neurobiologi Kursus for at bistå i Chef-tdTomato eksperimenter, PetronellaKettunen (Göteborgs Universitet ) for første samarbejde om optogenetic eksperimenter, BaljitKhakh, Eric Hudson, Mike Baca og John Milligan (UCLA) for teknisk rådgivning og Roger Tsien (UCSD) til Chef-tdTomato konstruere. Dette arbejde blev støttet af en NRSA (5F31NS064817) tildeling til AMSP og en bevilling fra NSF (RIG: 0.819.010) til AS.

Forbered følgende før tid. 1. Forbered Optic Cable <ol><li> Skabe en opbevaringsenhed for den optiske kabel ved at smelte den tilspidsede hals på en glas Pasteur-pipette over en bunsenbrænder at skabe et ~ 150 ° vinkel. </li><li> Ved hjælp af en bidetang eller et barberblad, omhyggeligt skåret den optiske kabel i to stykker. Hvert stykke skal have den ene ende med en FC / PC adapter og en eksponeret ende. Gem et stykke som en reserve-kabel. </li><li> Afisoler optisk kabel ned til be...

<ol>
	<li>Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+zebrafish+behavior+with+halorhodopsin.">Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17968-17973 (2009).</li><li>Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unidirectional+startle+responses+and+disrupted+left-right+co-ordination+of+motor+behaviors+in+robo3+mutant+zebrafish.">Unidirectional startle responses and disrupted left-right co-ordination of motor behaviors in robo3 mutant zebrafish.</a> Genes Brain Behav. 8 (5), 500-511 (2009).</li><li>Douglass, A. D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A. F., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+behavior+elicited+by+single,+channelrhodopsin-2-evoked+spikes+in+zebrafish+somatosensory+neurons.">Escape behavior elicited by single, channelrhodopsin-2-evoked spikes in zebrafish somatosensory neurons.</a> Curr. Biol. 18 (15), 1133-1137 (2008).</li><li>Downes, G. B., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supraspinal+input+is+dispensable+to+generate+glycine-mediated+locomotive+behaviors+in+the+zebrafish+embryo.">Supraspinal input is dispensable to generate glycine-mediated locomotive behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 66 (5), 437-451 (2006).</li><li>Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+locomotor+network+in+zebrafish.">Development of the locomotor network in zebrafish.</a> Prog. Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).</li><li>Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Cell+Extrusion+from+the+Epidermis+of+Developing+Zebrafish.">Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+the+Zebrafish+Embryonic+Brain+by+Confocal+Microscopy.">Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (26), e1217 (2009).</li><li>Kague, E., Weber, C., Fisher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+Zebrafish+Transgenesis+for+Evaluating+Enhancer+Sequences.">Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences.</a> J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+Chimeric+Zebrafish+Embryos+by+Transplantation.">Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (29), e1394 (2009).</li><li>Kohashi, T., Oda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+Mauthner-+or+non-Mauthner-mediated+fast+escape+evoked+by+different+modes+of+sensory+input.">Initiation of Mauthner- or non-Mauthner-mediated fast escape evoked by different modes of sensory input.</a> J. Neurosci. 28 (42), 10641-10653 (2008).</li><li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila.">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat. Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).</li><li>Liao, J. C., Haehnel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+afferent+neurons+in+larval+zebrafish+provides+a+functional+framework+for+lateral+line+somatotopy.">Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy.</a> J. Neurophysiol. 107 (10), 2615-2623 (2012).</li><li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics.">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li><li>Liu, K. S., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablations+reveal+functional+relationships+of+segmental+hindbrain+neurons+in+zebrafish.">Laser ablations reveal functional relationships of segmental hindbrain neurons in zebrafish.</a> Neuron. 23 (2), 325-335 (1999).</li><li>Liu, Y. C., Bailey, I., Hale, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+startle+motor+patterns+and+behaviors+in+the+larval+zebrafish+(Danio+rerio).">Alternative startle motor patterns and behaviors in the larval zebrafish (Danio rerio).</a> J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens Neural. Behav. Physiol. 198 (1), 11-24 (2012).</li><li>Palanca, A. M., Lee, S. L., Yee, L. E., Joe-Wong, C., Trinh, L. A., Hiroyasu, E., Husain, M., Fraser, S. E., Pellegrini, M., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+transgenic+reporters+identify+somatosensory+neuron+subtypes+in+larval+zebrafish.">New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. , (2012).</li><li>Pujol-Mart&#237;, J., Zecca, A., Baudoin, J. P., Faucherre, A., Asakawa, K., Kawakami, K., L&#243;pez-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+birth+order+identifies+a+dimorphic+sensorineural+map.">Neuronal birth order identifies a dimorphic sensorineural map.</a> J. Neurosci. 32 (9), 2976-2987 (2012).</li><li>Saint-Amant, L., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+the+development+of+motor+behaviors+in+the+zebrafish+embryo.">Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).</li><li>Szobota, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+activity+with+a+light-gated+glutamate+receptor.">Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor.</a> Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).</li><li>Uemura, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+functional+genomics+revealed+conservation+and+diversification+of+three+enhancers+of+the+isl1+gene+for+motor+and+sensory+neuron-specific+expression.">Comparative functional genomics revealed conservation and diversification of three enhancers of the isl1 gene for motor and sensory neuron-specific expression.</a> Dev. Biol. 278 (2), 587-606 (2005).</li><li>Wyart, C., Del Bene, F., Warp, E., Scott, E. K., Trauner, D., Baier, H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+dissection+of+a+behavioural+module+in+the+vertebrate+spinal+cord.">Optogenetic dissection of a behavioural module in the vertebrate spinal cord.</a> Nature. 461 (7262), 407-410 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos.">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).</li></ol>

Vi har beskrevet en metode til optogenetic aktivering af enkelte RB neuroner i levende zebrafisk. Vores metode anvender forbigående transgenese at udtrykke en fluorescens mærket channelrhodopsin variant, Chef-tdTomato 13, i særlige somatosensoriske neuroner. Denne fremgangsmåde kan let tilpasses til anvendelse i andre larve zebrafisk cellepopulationer. Brug af denne tilgang, vi konsekvent fremkaldte adfærdsmæssige reaktioner fra 34 til 48 HPF larver udtrykker Chef-tdTomato. ...

Udviklingen af optogenetic fremgangsmåder til at fremme eller inhibering af neuronal excitabilitet med definerede bølgelængder af lys har gjort det muligt at studere funktionen af forskellige populationer af neuroner i neurale kredsløb der styrer adfærd 1, 19, 21. Denne teknik anvendes ofte til at aktivere grupper af neuroner, men det kan også anvendes til aktivering af individuelle neuroner. Zebrafisk larver er særligt modtagelige for disse metoder, da de er gennemsigtige, deres nervesystem udvikler sig hurtigt, og skabe transgene dyr er hurtig og rutine. Dog skal betydelige tekniske forhindringer overvindes til pålideligt at opnå en enkelt neuron aktivering. For at optimere en procedure for optogenetic aktivering af enkelte zebrafisk neuroner, vi fokuserede på somatosensoriske neuroner. Zebrafisk larver opdage en bred vifte af somatosensoriske stimuli ved hjælp af to populationer af neuroner: trigeminale neuroner, der innerverer hoved og Rohon-skæg (RB) neuroner, som innerverer resten af ​​kroppen. Hver trigeminal og RB neuron forventer en perifer Axon, at filialer i udstrakt grad i huden til at opdage stimuli og en central axon, der forbinder til downstream neurale kredsløb. Dyr reagerer at røre så tidligt som 21 timer efter befrugtning (HPF), hvilket indikerer, at en sammenhængende somatosensoriske kredsløb har dannet 5, 18. Under larveudvikling mindste nogle trigeminal og RB neuroner synapse på Mauthner cellen for at aktivere klassiske escape reaktioner, men akkumulerende beviser tyder på, at der er flere klasser af somatosensoriske neuroner med forskellige mønstre til tilslutning, der kan fremkalde variationer på escape adfærd 2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17. Vores motivation for at udvikle denne metode var at karakterisere den adfærdsmæssige funktion af forskellige klasser af somatosensoriske neuroner, men denne fremgangsmåde kunne i princippet anvendes til at studere funktionen af ​​næsten enhver neuron eller population af neuroner i larval zebrafisk. Douglass et al. Tidligere beskrevet en fremgangsmåde til aktivering Channelrhodopsin-2-udtrykkende somatosensoriske neuroner med blåt lys, fremkalde escape adfærd 3. Deres tilgang anvendes en enhancer element fra isl1 genet at drive ekspression af CHR2-EYFP i somatosensoriske neuroner. Dette transgen blev imidlertid rapporteret at vise relativt svag fluorescens, der kræver co-injektion af en anden reporter, at UAS :: GFP, tillade visualisering af celler, der udtrykker CHR2-EYFP. Denne fremgangsmåde blev anvendt til at fremkalde adfærd reaktioner mellem 24-48 HPF, men aldrig kunne fremkalde en reaktion forbi 72 HPF. Mens denne metode virker for at studere neurale kredsløb i meget tidlige larvestadier (24-48 HPF), det er utilstrækkeligt til at karakterisere neurale kredsløb og adfærdsmæssige reaktioner hos ældre larver, når flere forskellige adfærdsmæssige reaktioner er synlige og neurale kredsløb er mere modne. Vi forsøgte atforbedre følsomheden af ​​denne teknik for at karakterisere funktionen af ​​subpopulationer af larve-RB neuroner. At forbedre ekspression brugte vi en somatosensoriske-specifik enhancer (CREST3) 20 at drive ekspression af LexA-VP16 og en strækning af LexA-operator-sekvenser (4xLexAop) 11 til at amplificere ekspressionen af en fluorescerende mærket lysaktiveret kanal. Denne konfiguration amplificeret ekspression af kanalen, hvilket eliminerer behovet for co-ekspression af en anden reporter, og tillader os at direkte bestemme den relative forekomst af kanalen i hver neuron. Ved hjælp af LexA / LexAop-sekvensen havde den yderligere fordel at tillade os at indføre transgenet i zebrafisk reporter linjer, der bruger Gal4/UAS system. Forbigående ekspression af dette transgen resulterede i varierende niveauer af ekspression, men var sædvanligvis tilstrækkelig robust til at visualisere både cellelegemet og axonale projektioner af individuelle neuroner over flere dage. For at optimere følsomtet at tænde vi brugte lyset aktiverede kanal Chef, en channelrhodopsin variant, der består af en kimære af channelopsin-1 (Chop1) og channelopsin-2 (Chop2) med en crossover websted på helix loop EF 13. Denne kanal er aktiveret ved den samme bølgelængde som CHR2, men kræver lavere lysintensitet for aktivering, hvilket gør det mere følsomme end andre almindeligt anvendte kanaler, herunder CHR2. Kokken protein blev fusioneret til rødt fluorescerende protein, tdTomato, så vi kan screene for proteinekspression uden at aktivere kanalen. Som lyskilde, anvendte vi en diode pumpet solid-state (DPSS) laser koblet til et fiberoptisk kabel til at levere en præcis, kraftig impuls af blåt lys i en specifik region af larverne. Dette tillod os at fokusere laserlys på individuelle neuroner, hvilket eliminerer behovet for at finde sjældne transgene dyr, der udtrykker kanalen på en enkelt neuron. Ved hjælp af denne metode, var vi i stand til at aktivere en enkelt RB neuroner, optage adfærdsmæssig reaktions med en high-speed video kamera, og billedet de aktiverede neuroner i høj opløsning med konfokal mikroskopi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens / Material </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Materialer </td></tr><tr><td> Glas Pasteurpipette </td><td> Fisher </td><td> 1367820B </td><td> eller tilsvarende (10-15 mm i diameter) </td></tr><tr><td> 200 um optisk fiber </td><td> Thorlabs </td><td> AFS200/220Y-CUSTOM </td><td> Patch Cord, Længde: 3 m, Afslut A: FC / PC, End B: FC / PC, Jakke: FT030 </td></tr><tr><td> 50 um optisk fiber </td><td> Thorlabs </td><td> AFS50/125Y-CUSTOM </td><td> Patch Cord, Længde: 3 m, Afslut A: FC / PC, End B: FC / PC, Jakke: FT030 </td></tr><tr><td> Justerbar afisoleringsværktøj </td><td> Thorlabs </td><td> AFS900 </td><td> eller tre-Hole afisoleringsværktøj (FTS4) </td></tr><tr><td> Diamond Wedge skriver </td><td> Thorlabs </td><td> S90W </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / Brown Mikropipette Puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> P-97 </td><td> eller tilsvarende </td></tr><tr><td> Borosilikatglas slange med glødetråd </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF-100-78-10 </td><td></td></tr><tr><td> Sprøjtestøbeform </td><td> n / a </td><td> n / a </td><td> Figur 5 </td></tr><tr><td> 1,5 ml centrifugerør </td><td> Enhver </td><td> Enhver </td><td></td></tr><tr><td> Petriskålen (100x15 mm) </td><td> Enhver </td><td> Enhver </td><td></td></tr><tr><td> Petriskålen (60x15 mm) </td><td> Enhver </td><td> Enhver </td><td></td></tr><tr><td> Pressure injektor </td><td> ASI </td><td> MPPI-3 </td><td> eller tilsvarende </td></tr><tr><td> Mikromanipulator og metalstativ </td><td> Narashige </td><td> M152 </td><td> eller tilsvarende </td></tr><tr><td> Engangs plast pipetter </td><td> Fisherbrand </td><td> 13-711-7 </td><td> eller tilsvarende </td></tr><tr><td> Poker (Pin holder og Insect pin) </td><td> Fin Science Tools, Inc. </td><td> 26.018-17 og 26.000-70 </td><td> eller tilsvarende </td></tr><tr><td> Tang </td><td> Fin Science Tools, Inc. </td><td> 11.255-20 </td><td> eller tilsvarende </td></tr><tr><td> Microloader pipettespidser </td><td> Eppendorf </td><td> 9300001007 </td><td></td></tr><tr><td> 28,5 ° C inkubator </td><td> enhver </td><td> enhver </td><td></td></tr><tr><td> 42 ° C varmeblok </td><td> Enhver </td><td> Enhver </td><td></td></tr><tr><td> Usterile skalpelblade # 11 </td><td> Fin videnskabelige redskaber, Inc. </td><td> 10.011-00 </td><td> eller tilsvarende </td></tr><tr><td> Dissekering sklare </td><td> Zeiss </td><td> STEMI </td><td> eller tilsvarende </td></tr><tr><td> Fluorescerende dissektionsmikroskop med standard filter </td><td> Enhver </td><td> enhver </td><td> eller tilsvarende </td></tr><tr><td> Konfokalt mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> LSM 510 eller 710 </td><td> eller tilsvarende med lasere til GFP og RFP, og 10x, 20x og 40x mål </td></tr><tr><td> Høj hastighed kamera </td><td> AOS Technologies, Inc. </td><td> X-PRI (130025-10) </td><td> eller tilsvarende </td></tr><tr><td> 473 nm bærbare laser </td><td> Crystal lasere </td><td> CL-473 til 050 </td><td> eller højere magt, med TTL option </td></tr><tr><td> S48 Stimulator </td><td> Astro-Med, Inc. Grass Instrument division </td><td> S48K </td><td> eller tilsvarende </td></tr><tr><td> FC / PC til FC / PC pasbøsning </td><td> Thorlabs </td><td> ADAFC1 </td><td> Maj need for optisk kabel tilslutning </td></tr><tr><td> Lasersikkerhed Briller </td><td> Thorlabs </td><td> LG10 </td><td> eller tilsvarende </td></tr><tr><td> 24 dyrkningsplader </td><td> Genesee </td><td> 25-102 </td><td> eller tilsvarende </td></tr><tr><td> Single depression dias </td><td> Fisher </td><td> S175201 </td><td> Eller tilsvarende </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Instant Ocean </td><td> Vandøkosystemer </td><td> IS50 </td><td></td></tr><tr><td> Methylenblåt </td><td> Fisher </td><td> S71325 </td><td></td></tr><tr><td> Phenolrødt </td><td> Sigma </td><td> P4758 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> EMD </td><td> 2125 </td><td> eller tilsvarende </td></tr><tr><td> Lavtsmeltende agarose </td><td> Sigma </td><td> A9045 </td> &lt;td&gt; eller tilsvarende </td></tr><tr><td> PTU </td><td> Sigma </td><td> P7629 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> Sigma </td><td> A5040 </td><td></td></tr><tr><td> blå / embryo vand </td><td></td><td></td><td> 10 L ddH 2 O 0,6 g Instant Ocean 6 dråber methylenblåt </td></tr><tr><td> phenolrødt </td><td></td><td></td><td> (5 mg / ml i 0,2 M KCI) </td></tr><tr><td> 100x PTU </td><td></td><td></td><td> 0,150 g PTU 50 ml ddH 2 O opløses ved 70 ° C, omrystes ofte portion og opbevar ved -20 ° C </td></tr><tr><td> 1x PTU </td><td></td><td></td><td> 1 ml 100x PTU 99 ml blå / fiskevand </td></tr><tr><td> Tricaine stamopløsning </td><td></td><td></td><td> 400 mg tricaine 97,9 ddH 2 O </td></tr><tr><td> ~ 2,1 ml 1 M Tris, pH 9,0 </td><td></td><td></td> &lt;td&gt; justere pH til ~ 7,0 opbevares i 4 ° C eller -20 ° C til langtidsopbevaring </td></tr></tbody></table>

optogenetic activation of zebrafish somatosensory neurons using chef-tdtomato

Larvestadium zebrafisk dukker op som en model til at beskrive udviklingen og funktionen af ​​simple neurale kredsløb. På grund af deres eksterne befrugtning, hurtige udvikling, og gennemskinnelighed, er zebrafisk særlig velegnet til optogenetic fremgangsmåder til at undersøge neural kredsløbsfunktion. I denne fremgangsmåde er lysfølsomme ionkanaler udtrykkes i specifikke neuroner, således eksperimentatoren for at aktivere eller inhibere dem efter behag og derved vurdere deres bidrag til specifikke adfærd. Anvendelse af disse metoder i larvernes zebrafisk er begrebsmæssigt enkel, men kræver optimering af tekniske detaljer. Her har vi demonstrere en procedure til at udtrykke et channelrhodopsin variant i larvernes zebrafisk somatosensoriske neuroner, foto-aktiverende enkelte celler, og registrere deraf adfærd. Ved at indføre et par ændringer til tidligere etablerede metoder, kan denne fremgangsmåde anvendes til at fremkalde adfærdsmæssige reaktioner fra enkelte neuroner aktiverede optil mindst 4 dage efter befrugtning (DPF). Konkret har vi skabt et transgen ved hjælp af en somatosensoriske neuron enhancer, CREST3, at drive ekspressionen af den mærkede channelrhodopsin variant, Chef-tdTomato. Injektion af dette transgen i 1-celle embryoer resulterer i mosaik ekspression i somatosensoriske neuroner, der kan afbildes med konfokal mikroskopi. Illuminating identificerede celler i disse dyr med lys fra en 473 nm DPSS laser, guidet gennem et fiberoptisk kabel, fremkalder adfærd, der kan optages med en high-speed video kamera og analyseret kvantitativt. Denne teknik kan tilpasses til at studere adfærd fremkaldt ved at aktivere nogen zebrafisk neuron. Ved at kombinere denne tilgang med genetiske eller farmakologiske forstyrrelser vil være en effektiv måde til at undersøge kredsløb dannelse og funktion.

<img src="/files/ftp_upload/50184/50184fig1.jpg" alt="Figur 1"/> Figur 1. Optisk kabel oprettet. (A) lag af et fiberoptisk kabel. (B) Afisoleret fiberoptisk kabel i en Pasteur-pipette. (C) Fiberoptisk kabel i Pasteur pipette placeres ved hjælp af en mikromanipulator. <img src="/files/ftp_upload/50184/50184fig2.jpg" alt="Figur 2"/> Figur 2. Sprøjtestøbe skabelon. <p c...

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato at JoVE.com

Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

Optogenetic teknikker har gjort det muligt at studere bidrag fra bestemte neuroner til adfærd. Vi beskriver en metode i larvernes zebrafisk til aktivering enkelt somatosensoriske neuroner udtrykker et channelrhodopsin variant (kok) med en diode-pumpet solid state (DPSS) laser og registrere fremkaldte adfærd med en high-speed video kamera.

Optogenetic Aktivering af zebrafisk somatosensoriske Neuroner med Chef-tdTomato

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons

Brug af Affordable LED-arrays for Foto-Stimulation af neuroner

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selektiv Viral transduktion af Voksen-fødte olfaktoriske neuroner for Kronisk In vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Metode til High Fidelity optogenetic Kontrol af Individuelle pyramideneuroner<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Optogenetic Stimulering af hørenerven

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Somatosensory Event-related Potentials from Orofacial Skin Stretch Stimulation

Somatosensorisk event-relaterede potentialer fra Orofacial Skin Stretch Stimulation

Cortical processing associated with orofacial somatosensory function in speech has received limited experimental attention due to the difficulty of ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

Müller Glia celle aktivering i en Laser-induceret Retinal Degeneration og Regeneration Model i zebrafisk

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging neurale aktivitet i den primære somatosensoriske Cortex ved hjælp af Thy1-GCaMP6s Transgene mus

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Sporing Drosophila larve adfærd som svar på Optogenetic Stimulation af olfaktoriske neuroner

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Isolation og RNA udvinding af neuroner, makrofager og mikroglia fra larve zebrafisk hjerner

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...