Name: optogenetic activation of zebrafish somatosensory neurons using chef-tdtomato
Uploaded: 2013-01-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato at JoVE.com

Wir danken Fumi Kubo, Tod Thiele und HerwigBaier (UCSF / Max-Planck-Institut) zur Beratung über das Verhalten Experimente und DPSS-Laser eingerichtet; Heesoo Kim und Chiara Cerri aus der MBL Neurobiologie Kurs für die Unterstützung in der Chef-tdTomato Experimente; PetronellaKettunen (University of Gothenburg ) für die erste Zusammenarbeit auf optogenetische Experimente; BaljitKhakh, Eric Hudson, Mike Baca und John Milligan (UCLA) für technische Beratung und Roger Tsien (UCSD) für den Chef-tdTomato konstruieren. AS: Diese Arbeit wurde durch ein NRSA (5F31NS064817) Auszeichnung AMSP und einem Zuschuss von der NSF (0.819.010 RIG) unterstützt.

Bereiten Sie die folgenden vor der Zeit. Ein. Bereiten Sie Optic Cable <ol><li> Erstellen einer Speichereinheit für die Lichtwellenleiter durch Schmelzen des verjüngten Hals einer Pasteurpipette aus Glas über einem Bunsenbrenner ein ~ 150 °-Winkel zu erzeugen. </li><li> Mit einem Seitenschneider oder einer Rasierklinge schneiden Sie vorsichtig die Glasfaserkabel in zwei Stücke. Jedes Stück sollte einen Ende mit einem FC / PC-Adapter und ein freiliegendes Ende aufweisen. Bewahren Sie ...

<ol>
	<li>Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+zebrafish+behavior+with+halorhodopsin.">Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17968-17973 (2009).</li><li>Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unidirectional+startle+responses+and+disrupted+left-right+co-ordination+of+motor+behaviors+in+robo3+mutant+zebrafish.">Unidirectional startle responses and disrupted left-right co-ordination of motor behaviors in robo3 mutant zebrafish.</a> Genes Brain Behav. 8 (5), 500-511 (2009).</li><li>Douglass, A. D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A. 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K., Trauner, D., Baier, H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+dissection+of+a+behavioural+module+in+the+vertebrate+spinal+cord.">Optogenetic dissection of a behavioural module in the vertebrate spinal cord.</a> Nature. 461 (7262), 407-410 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos.">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).</li></ol>

Wir haben einen Ansatz für optogenetische Aktivierung der einzelnen RB Neuronen im Live Zebrafisch beschrieben. Unsere Methode beschäftigt transiente Transgenese einen fluoreszenzmarkierten Channelrhodopsin Variante Chef-tdTomato 13, in bestimmten somatosensorischen Neuronen auszudrücken. Dieser Ansatz könnte leicht zur Verwendung in anderen larvalen Zebrafisch Zellpopulationen angepasst werden. Mit diesem Ansatz konsequent ausgelöst Verhaltensreaktionen 34 bis 48 hpf Larven ...

Die Entwicklung optogenetische Verfahren zur Förderung oder Hemmung neuronaler Erregbarkeit mit definierten Wellenlängen von Licht hat es möglich gemacht, um die Funktion der unterschiedlichen Populationen von Neuronen in der neuronalen Schaltkreise Regelung des Verhaltens 1, 19, 21 zu studieren. Diese Technik wird oft verwendet, um Gruppen von Neuronen zu aktivieren, aber es kann auch verwendet werden, um einzelne Neuronen aktiviert werden. Zebrafisch-Larven sind besonders empfänglich zu diesen Methoden, da sie durchsichtig sind, entwickelt ihr Nervensystem schnell, und die Schaffung von transgenen Tieren ist schnell und Routine. Allerdings müssen erhebliche technische Hürden zu überwinden, um sicher zu erreichen einzelnes Neuron aktiviert werden. Um ein Verfahren zur optogenetische Aktivierung der einzelnen Zebrafisch Neuronen zu optimieren, haben wir uns auf somatosensorischen Neuronen. Zebrafischlarven erkennen eine Vielzahl von somatosensorischen Reize mit zwei Populationen von Neuronen: Trigeminus Neuronen, die den Kopf innervieren und Rohon-Beard (RB) Neuronen, die den Rest des Körpers innervieren. Jedes Neuron trigeminaler und RB projiziert einen peripheren Axon dass Zweige extensiv in der Haut auf Reize und eine zentrale, die Axon stromabwärts neuronalen Schaltkreise verbindet detektieren. Tiere reagieren, so früh wie 21 Stunden nach der Befruchtung (hpf) berühren, was darauf hinweist, dass eine kohärente somatosensorischen Schaltungen 5 gebildet, 18. Während Larvalentwicklung zumindest einige trigeminaler und RB Neuronen Synapse auf die Zelle zu aktivieren Mauthner klassischen Escape Reaktionen, aber vermehrt Hinweise darauf deutet, dass es mehrere Klassen von somatosensorischen Neuronen mit unterschiedlichen Mustern auf die Anbindung, die Variationen des Fluchtverhalten 2, 4 hervorrufen kann, 10, 12, 14, 15, 16, 17. Unsere Motivation zur Entwicklung dieser Verfahren war, die Verhaltens-Funktion von verschiedenen Klassen von Neuronen somatosensorischen charakterisieren, aber dieser Ansatz könnte im Prinzip verwendet werden, um die Funktion von nahezu jedem Neuron oder Population von Neuronen in lar studierenval Zebrafisch. Douglass et al. Zuvor beschrieben ein Verfahren zur Aktivierung Channelrhodopsin-2-Expression somatosensorischen Neuronen mit blauem Licht, entlocken Fluchtverhalten 3. Ihr Ansatz verwendet ein Enhancer-Element aus dem ISL1 Gen zur Expression von ChR2-EYFP in somatosensorischen Neuronen fahren. Dieses Transgen wurde jedoch berichtet, dass relativ schwache Fluoreszenz anzuzeigen, erfordern Coinjektion eines zweiten Reporters, um UAS :: GFP erlauben Visualisierung der Zellen, die EYFP-ChR2. Dieser Ansatz wurde verwendet, um das Verhalten Antworten zwischen 24-48 hpf entlocken, konnte aber nie eine Reaktion hervor letzten 72 hpf. Während also diese Methode funktioniert für das Studium neuronalen Schaltkreisen in einem sehr frühen Larvenstadien (24-48 hpf), ist es nicht ausreichend für die Charakterisierung von neuronalen Schaltkreisen und Verhaltensreaktionen bei älteren Larven, wenn mehr diverse Verhaltensreaktionen offensichtlich sind und neuronale Schaltkreise sind reifer. Wir versuchten,Verbesserung der Empfindlichkeit dieser Technik, um die Funktion von Subpopulationen von Larven RB Neuronen zu charakterisieren. Verbesserung der Expression verwendeten wir eine somatosensorischen-spezifischen Enhancer (CREST3) 20, um die Expression von LexA-VP16 und eine Strecke von LexA Operatorsequenzen (4xLexAop) 11 anzutreiben, um die Expression eines fluoreszierend markierten lichtaktivierten Kanal amplifizieren. Diese Konfiguration verstärkten Expression des Kanals, wodurch die Notwendigkeit für Co-Expression eines zweiten Reportergens und es uns ermöglicht, direkt die relative Häufigkeit des Kanals in jedem Neuron. Verwendung des LexA / LexAop Sequenz hatte den zusätzlichen Vorteil, dass es uns, die das Transgen in Zebrafische Linien, die die Reporter-System verwenden Gal4/UAS einzuführen. Transiente Expression dieses Transgen führte in verschiedenen Ebenen des Ausdrucks, sondern war in der Regel robust genug, um sowohl den Zellkörper und axonale Projektionen einzelner Neuronen über mehrere Tage zu visualisieren. Um sensitiv zu optimierenkeit zu beleuchten haben wir das Licht aktiviert Kanal Koch, ein Channelrhodopsin Variante, bestehend aus einer Chimäre channelopsin-1 (Chop1) und channelopsin-2 (CHOP2) mit einem Crossover-Website unter Helix-Schleife EF 13. Dieser Kanal wird bei der gleichen Wellenlänge wie ChR2 aktiviert, sondern erfordert geringere Lichtintensität für die Aktivierung, wodurch es empfindlicher als andere üblicherweise verwendete Kanäle, einschließlich ChR2. Der Küchenchef Protein wurde das rot fluoreszierende Protein, tdTomato verschmolzen, so dass wir für die Proteinexpression ohne Aktivierung des Kanals zu screenen. Als Lichtquelle verwendeten wir einen diodengepumpten Festkörperlaser (DPSS)-Laser, der mit einem faseroptischen Kabel, um eine präzise, ​​High-Power Pulses von blauem Licht auf eine bestimmte Region der Larven zu liefern. Dies erlaubte uns, Laserlicht auf einzelnen Neuronen zu konzentrieren, wodurch die Notwendigkeit für die Suche nach seltenen transgenen Tieren Ausdruck der Kanal in einem einzelnen Neuron. Mit diesem Ansatz konnten wir einzelne RB Neuronen zu aktivieren, notieren Verhaltensreaktions mit einem High-Speed-Video-Kamera und Bild die aktivierten Neuronen bei hoher Auflösung mit der konfokalen Mikroskopie.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Materialien </td></tr><tr><td> Glas Pasteurpipette </td><td> Fischer </td><td> 1367820B </td><td> o. dgl. (10-15 mm Durchmesser) </td></tr><tr><td> 200 &amp;mgr; Glasfaser </td><td> Thorlabs </td><td> AFS200/220Y-CUSTOM </td><td> Patchkabel, Länge: 3 m, A: FC / PC, B: FC / PC, Jacket: FT030 </td></tr><tr><td> 50 um Glasfaser </td><td> Thorlabs </td><td> AFS50/125Y-CUSTOM </td><td> Patchkabel, Länge: 3 m, A: FC / PC, B: FC / PC, Jacket: FT030 </td></tr><tr><td> Einstellbare Stripping Tool </td><td> Thorlabs </td><td> AFS900 </td><td> oder Drei-Loch Stripping Tool (FTS4) </td></tr><tr><td> Diamant Wedge Schreiber </td><td> Thorlabs </td><td> S90W </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / Brown Feinpipettenziehvorrichtung </td><td> Sutter Instruments </td><td> P-97 </td><td> oder gleichwertige </td></tr><tr><td> Borosilicatglasröhren mit Filament </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF-100-78-10 </td><td></td></tr><tr><td> Spritzgießwerkzeug </td><td> n / a </td><td> n / a </td><td> Abbildung 5 </td></tr><tr><td> 1,5 ml Zentrifugenröhrchen </td><td> Jeder </td><td> Jeder </td><td></td></tr><tr><td> Petrischale (100x15 mm) </td><td> Jeder </td><td> Jeder </td><td></td></tr><tr><td> Petrischale (60x15 mm) </td><td> Jeder </td><td> Jeder </td><td></td></tr><tr><td> Injektor </td><td> ASI </td><td> MPPI-3 </td><td> oder gleichwertige </td></tr><tr><td> Mikromanipulator und Metallständer </td><td> Narashige </td><td> M152 </td><td> oder gleichwertige </td></tr><tr><td> Einweg-Pipetten </td><td> Fisherbrand </td><td> 13-711-7 </td><td> oder gleichwertige </td></tr><tr><td> Poker (Pin Halter und Insekten pin) </td><td> Fine Science Tools, Inc. </td><td> 26018-17 und 26000-70 </td><td> oder gleichwertige </td></tr><tr><td> Zange </td><td> Fine Science Tools, Inc. </td><td> 11255-20 </td><td> oder gleichwertige </td></tr><tr><td> Microloader Pipettenspitzen </td><td> Eppendorf </td><td> 9300001007 </td><td></td></tr><tr><td> 28,5 ° C Inkubator </td><td> jeder </td><td> jeder </td><td></td></tr><tr><td> 42 ° C Heizblock </td><td> Jeder </td><td> Jeder </td><td></td></tr><tr><td> Non-Sterile Skalpellklingen Nr. 11 </td><td> Feine Scientific Tools, Inc. </td><td> 10011-00 </td><td> oder gleichwertige </td></tr><tr><td> Sezieren szurechtkommen </td><td> Zeiss </td><td> Stemi </td><td> oder gleichwertige </td></tr><tr><td> Fluorescent Binokular mit Standard-Filter </td><td> Jeder </td><td> jeder </td><td> oder gleichwertige </td></tr><tr><td> Konfokalmikroskop </td><td> Zeiss </td><td> LSM 510 oder 710 </td><td> oder gleichwertig mit Lasern für GFP und RFP und 10x, 20x und 40x </td></tr><tr><td> High-Speed-Kamera </td><td> AOS Technologies, Inc. </td><td> X-PRI (130025-10) </td><td> oder gleichwertige </td></tr><tr><td> 473 nm tragbare Laser </td><td> Kristall-Laser </td><td> CL-473 bis 050 </td><td> oder höhere Macht, mit TTL-Option </td></tr><tr><td> S48 Stimulator </td><td> Astro-Med, Inc. Grass Instrument Division </td><td> S48K </td><td> oder gleichwertige </td></tr><tr><td> FC / PC auf FC / PC Verbindungshülse </td><td> Thorlabs </td><td> ADAFC1 </td><td> May need für LWL-Verbindung </td></tr><tr><td> Laserschutzbrillen </td><td> Thorlabs </td><td> LG10 </td><td> oder gleichwertige </td></tr><tr><td> 24 Petrischalen </td><td> Genesee </td><td> 25-102 </td><td> oder gleichwertige </td></tr><tr><td> Einzel Depressionen Dias </td><td> Fischer </td><td> S175201 </td><td> Oder gleichwertig </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Instant Ocean </td><td> Aquatic Ecosystems </td><td> IS50 </td><td></td></tr><tr><td> Methylenblau </td><td> Fischer </td><td> S71325 </td><td></td></tr><tr><td> Phenolrot </td><td> Sigma </td><td> P4758 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> EMD </td><td> 2125 </td><td> oder gleichwertige </td></tr><tr><td> Low Melt Agarose </td><td> Sigma </td><td> A9045 </td> &lt;td&gt; oder gleichwertig </td></tr><tr><td> PTU </td><td> Sigma </td><td> P7629 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> Sigma </td><td> A5040 </td><td></td></tr><tr><td> blau / Embryo Wasser </td><td></td><td></td><td> 10 L ddH 2 O 0,6 g Instant Ocean 6 Tropfen Methylenblau </td></tr><tr><td> Phenolrot </td><td></td><td></td><td> (5 mg / ml in 0,2 M KCl) </td></tr><tr><td> 100x PTU </td><td></td><td></td><td> 0,150 g PTU 50 ml ddH 2 O lösen sich bei 70 ° C, oft schütteln aliquotieren und bei -20 ° C </td></tr><tr><td> 1x PTU </td><td></td><td></td><td> 1 ml 100x PTU 99 ml blau / Fisch Wasser </td></tr><tr><td> Tricaine Stammlösung </td><td></td><td></td><td> 400 mg Tricain 97,9 ddH 2 O </td></tr><tr><td> ~ 2,1 ml 1M Tris, pH 9,0, </td><td></td><td></td> &lt;td&gt; pH-Wert auf ~ 7,0 store in 4 ° C oder -20 ° C für die langfristige Lagerung </td></tr></tbody></table>

optogenetic activation of zebrafish somatosensory neurons using chef-tdtomato

Larven Zebrafisch als Modell für die Beschreibung der Entwicklung und Funktion von einfachen neuronalen Schaltungen entstehen. Aufgrund ihrer äußeren Befruchtung rasante Entwicklung, und Transluzenz werden Zebrafisch besonders gut für optogenetische Ansätze geeignet neuronalen Schaltkreis Funktion zu untersuchen. In diesem Ansatz werden lichtempfindlichen Ionenkanäle in bestimmten Neuronen exprimiert, so dass die Versuchsleiter zu aktivieren oder hemmen sie an Willen und somit beurteilen, ihren Beitrag zur spezifischen Verhaltensweisen. Die Anwendung dieser Methoden in der larvalen Zebrafisch ist konzeptionell einfach, erfordert aber die Optimierung der technischen Details. Hier zeigen wir, ein Verfahren zur Expression eines Channelrhodopsin Variante im Larvenstadium Zebrafisch somatosensorischen Neuronen, photo-aktivierenden Einzelzellen, und Aufzeichnen der resultierenden Verhaltensweisen. Durch die Einführung von ein paar Änderungen an bereits etablierten Methoden, könnte dieser Ansatz verwendet werden, um Verhaltensreaktionen von einzelnen Neuronen aktiviert bis hervorzurufenmindestens 4 Tagen nach der Befruchtung (dpf). Konkret haben wir ein Transgen mit einem somatosensorischen Neuronen Enhancer, CREST3, um den Ausdruck des markierten Channelrhodopsin Variante Chef-tdTomato fahren. Injektion dieses Transgen in 1-Zellen-Stadium Embryonen führt Mosaik Expression in somatosensorischen Neuronen, die mit Konfokalmikroskopie abgebildet werden können. Beleuchten identifizierten Zellen in diesen Tieren mit Licht von einer 473 nm Laser DPSS, geführt durch ein Glasfaserkabel, hervorruft Verhaltensweisen, die mit einer Hochgeschwindigkeits-Videokamera aufgezeichnet und analysiert werden können quantitativ. Diese Technik könnte zur Studie Verhaltensweisen hervorgerufen durch Aktivierung keine Zebrafisch Neuron angepasst werden. Kombiniert mit genetischen oder pharmakologischen Störungen wird eine leistungsfähige Methode zur Schaltung Bildung und Funktion zu untersuchen.

<img src="/files/ftp_upload/50184/50184fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Optic-Kabel eingerichtet. (A) Ebenen eines faseroptischen Kabels. (B) Stripped Glasfaserkabels in einer Pasteurpipette. (C) LWL-Kabel in Pasteurpipette positioniert mit einem Mikromanipulator. <img src="/files/ftp_upload/50184/50184fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Spritzgießwerkzeug Vorlage....

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Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

Optogenetische Techniken haben es ermöglicht, den Beitrag der spezifischen Neuronen zu studieren. Wir beschreiben ein Verfahren in larvalen Zebrafisch zur Aktivierung einzelner somatosensorischen Neuronen Ausdruck einer Channelrhodopsin Variante (Chef) mit einem diodengepumpten Festkörperlaser (DPSS-Laser) und Aufzeichnung der ausgelöste Verhalten mit einem High-Speed-Video-Kamera.

Optogenetische Aktivierung der Zebrafisch Somatosensory Neuronen mit Chef-tdTomato

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

Targeting Riechhirn Neuronen mit kombinierten In Vivo Elektroporation und Gal4-Based Enhancer-Trap Zebrafischlinien

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Forschung

Neurowissenschaften

Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons

Mit Affordable LED Arrays für Photo-Stimulation von Neuronen

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

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Selektive Viral Transduktion von Adult-geboren olfaktorischen Neuronen für chronische In vivo Optogenetische Stimulation

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A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

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Eine Methode zur High Fidelity optogenetische Kontrolle der Einzelpyramidenzellen<em&gt; In-vivo-</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

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Optogenetische Stimulation des Hörnervs

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

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M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

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To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...