Name: optogenetic activation of zebrafish somatosensory neurons using chef-tdtomato
Uploaded: 2013-01-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato at JoVE.com

Vi takker Fumi Kubo, Tod Thiele og HerwigBaier (UCSF / Max Planck Institute) for råd om atferd eksperimenter og DPSS laser satt opp, Heesoo Kim og Chiara Cerri fra MBL nevrobiologi Kurs for å bistå i Chef-tdTomato eksperimenter; PetronellaKettunen (Göteborgs Universitet ) for første samarbeid om optogenetic eksperimenter; BaljitKhakh, Eric Hudson, Mike Baca og John Milligan (UCLA) for teknisk rådgivning, og Roger Tsien (UCSD) for kokk-tdTomato konstruere. Dette arbeidet ble støttet av en NRSA (5F31NS064817) prisen til AMSP og et stipend fra NSF (RIG: 0819010) til AS.

Forbered følgende forhånd. 1. Forbered Optic Cable <ol><li> Registrer oppbevaringsenhet for den optiske kabelen ved smelting avsmalnende hals av et glass Pasteur-pipette over en Bunsen-brenner til å opprette en ~ 150 ° vinkel. </li><li> Ved hjelp av en wire cutter eller et barberblad, må du kutte optisk kabel i to deler. Hver del bør ha en ende med en FC / PC adapter og en eksponert ende. Lagre ett stykke som en reserve-kabel. </li><li> Stripe optisk kabel ned til kapslingen ved å f...

<ol>
	<li>Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+zebrafish+behavior+with+halorhodopsin.">Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17968-17973 (2009).</li><li>Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unidirectional+startle+responses+and+disrupted+left-right+co-ordination+of+motor+behaviors+in+robo3+mutant+zebrafish.">Unidirectional startle responses and disrupted left-right co-ordination of motor behaviors in robo3 mutant zebrafish.</a> Genes Brain Behav. 8 (5), 500-511 (2009).</li><li>Douglass, A. D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A. F., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+behavior+elicited+by+single,+channelrhodopsin-2-evoked+spikes+in+zebrafish+somatosensory+neurons.">Escape behavior elicited by single, channelrhodopsin-2-evoked spikes in zebrafish somatosensory neurons.</a> Curr. Biol. 18 (15), 1133-1137 (2008).</li><li>Downes, G. B., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supraspinal+input+is+dispensable+to+generate+glycine-mediated+locomotive+behaviors+in+the+zebrafish+embryo.">Supraspinal input is dispensable to generate glycine-mediated locomotive behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 66 (5), 437-451 (2006).</li><li>Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+locomotor+network+in+zebrafish.">Development of the locomotor network in zebrafish.</a> Prog. Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).</li><li>Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Cell+Extrusion+from+the+Epidermis+of+Developing+Zebrafish.">Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+the+Zebrafish+Embryonic+Brain+by+Confocal+Microscopy.">Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (26), e1217 (2009).</li><li>Kague, E., Weber, C., Fisher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+Zebrafish+Transgenesis+for+Evaluating+Enhancer+Sequences.">Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences.</a> J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+Chimeric+Zebrafish+Embryos+by+Transplantation.">Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (29), e1394 (2009).</li><li>Kohashi, T., Oda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+Mauthner-+or+non-Mauthner-mediated+fast+escape+evoked+by+different+modes+of+sensory+input.">Initiation of Mauthner- or non-Mauthner-mediated fast escape evoked by different modes of sensory input.</a> J. Neurosci. 28 (42), 10641-10653 (2008).</li><li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila.">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat. Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).</li><li>Liao, J. C., Haehnel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+afferent+neurons+in+larval+zebrafish+provides+a+functional+framework+for+lateral+line+somatotopy.">Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy.</a> J. Neurophysiol. 107 (10), 2615-2623 (2012).</li><li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics.">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li><li>Liu, K. S., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablations+reveal+functional+relationships+of+segmental+hindbrain+neurons+in+zebrafish.">Laser ablations reveal functional relationships of segmental hindbrain neurons in zebrafish.</a> Neuron. 23 (2), 325-335 (1999).</li><li>Liu, Y. C., Bailey, I., Hale, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+startle+motor+patterns+and+behaviors+in+the+larval+zebrafish+(Danio+rerio).">Alternative startle motor patterns and behaviors in the larval zebrafish (Danio rerio).</a> J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens Neural. Behav. Physiol. 198 (1), 11-24 (2012).</li><li>Palanca, A. M., Lee, S. L., Yee, L. E., Joe-Wong, C., Trinh, L. A., Hiroyasu, E., Husain, M., Fraser, S. E., Pellegrini, M., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+transgenic+reporters+identify+somatosensory+neuron+subtypes+in+larval+zebrafish.">New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. , (2012).</li><li>Pujol-Mart&#237;, J., Zecca, A., Baudoin, J. P., Faucherre, A., Asakawa, K., Kawakami, K., L&#243;pez-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+birth+order+identifies+a+dimorphic+sensorineural+map.">Neuronal birth order identifies a dimorphic sensorineural map.</a> J. Neurosci. 32 (9), 2976-2987 (2012).</li><li>Saint-Amant, L., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+the+development+of+motor+behaviors+in+the+zebrafish+embryo.">Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).</li><li>Szobota, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+activity+with+a+light-gated+glutamate+receptor.">Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor.</a> Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).</li><li>Uemura, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+functional+genomics+revealed+conservation+and+diversification+of+three+enhancers+of+the+isl1+gene+for+motor+and+sensory+neuron-specific+expression.">Comparative functional genomics revealed conservation and diversification of three enhancers of the isl1 gene for motor and sensory neuron-specific expression.</a> Dev. Biol. 278 (2), 587-606 (2005).</li><li>Wyart, C., Del Bene, F., Warp, E., Scott, E. K., Trauner, D., Baier, H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+dissection+of+a+behavioural+module+in+the+vertebrate+spinal+cord.">Optogenetic dissection of a behavioural module in the vertebrate spinal cord.</a> Nature. 461 (7262), 407-410 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos.">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).</li></ol>

Vi har beskrevet en tilnærming for optogenetic aktivering av enkle RB nevroner i levende sebrafisk. Vår metode benytter forbigående transgenesis å uttrykke en fluorescently merket channelrhodopsin variant, kokk-tdTomato 13, i bestemte somatosensoriske nerveceller. Denne tilnærmingen kan lett tilpasses for bruk i andre larve sebrafisk cellepopulasjoner. Ved hjelp av denne tilnærmingen vi konsekvent fremkalte atferdsresponser 34-48 HPF larver uttrykker Chef-tdTomato. Ved hjelp...

Utviklingen av optogenetic metoder for å fremme eller hemme neuronal eksitabilitet med definerte bølgelengder av lys har gjort det mulig å studere funksjonen av distinkte populasjoner av nevroner i neural kretser kontrollerende 1 oppførsel, 19, 21. Denne teknikken er ofte brukt til å aktivere grupper av nerveceller, men det kan også brukes til å aktivere enkelte nerveceller. Sebrafisk larver er spesielt mottagelig for disse metodene siden de er gjennomsiktig, utvikler nervesystemet raskt, og skape transgene dyr er rask og rutine. Må imidlertid betydelige tekniske hindrene må overvinnes for å pålitelig oppnå enkelt Nevron aktivering. For å optimalisere en prosedyre for optogenetic aktivering av enkle sebrafisk nevroner, fokuserte vi på somatosensoriske nerveceller. Sebrafisk larver oppdage en rekke somatosensoriske stimuli ved hjelp av to populasjoner av nerveceller: trigeminal nevroner, som innerverer hodet, og Rohon-Beard (RB) nevroner, som innerverer resten av kroppen. Hver trigeminal og RB neuron projiserer en perifer axon som grener i stor utstrekning i huden for å oppdage stimuli og en sentral axon som kobles til nedstrøms nevrale kretser. Dyr reagerer når du trykker så tidlig som 21 timer etter befruktning (HPF), noe som indikerer at sammenhengende somatosensoriske kretser har dannet 5, 18. Under larveutvikling minst noen trigeminal og RB nevroner synapse på Mauthner celle for å aktivere klassiske flukt svar, men samler bevis tyder på at det er flere klasser av somatosensoriske nevroner med ulike mønstre av tilkoblingsmuligheter som kan lokke fram variasjoner på flukt atferd 2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17. Vår motivasjon for å utvikle denne metoden var å karakterisere de atferdsmessige funksjon av ulike klasser av somatosensoriske nevroner, men denne tilnærmingen kan i prinsippet brukes til å studere funksjonen til nesten alle nervecellen eller populasjon av nevroner i Larval sebrafisk. Douglass et al. Tidligere beskrevet en fremgangsmåte for aktivering av Channelrhodopsin-2-uttrykkende somatosensoriske nevroner med blått lys, fremlokkende flykte atferd 3. Deres tilnærming brukte en forsterker element fra isl1 genet til å kjøre uttrykk for ChR2-EYFP i somatosensoriske nerveceller. Denne transgenet, ble imidlertid rapportert å vise relativt svak fluorescens, krever samtidig injeksjon av en andre reporter til UAS :: GFP, tillate visualisering av celler som uttrykker ChR2-EYFP. Denne tilnærmingen ble brukt til å lokke fram atferd svar mellom 24-48 HPF, men kunne aldri lokke fram en reaksjon forbi 72 HPF. Således, mens denne metoden fungerer for å studere nevrale kretser på veldig tidlig larvestadier (24-48 HPF), er det utilstrekkelig for å karakterisere nevrale kretser og atferdsmessige reaksjoner på eldre larver, når flere ulike atferdsmessige reaksjoner er tydelige og nevrale kretser er mer moden. Vi søkt åforbedre følsomheten av denne teknikken for å karakterisere funksjonen av subpopulasjoner av larve RB nerveceller. For å forbedre uttrykk vi brukte en somatosensoriske-spesifikk forsterker (CREST3) 20 for å drive uttrykk for Lexa-VP16 og en strekning av Lexa operatør sekvenser (4xLexAop) 11 å forsterke uttrykk for en fluorescently merket lysaktivert kanal. Denne konfigurasjonen forsterket uttrykk for kanalen, noe som eliminerer behovet for koordinering uttrykker en andre reporter og tillater oss å direkte bestemme den relative overflod av kanalen i hver neuron. Bruke Lexa / LexAop sekvens hadde den ekstra fordelen av å la oss til å introdusere transgene inn sebrafisk reporter linjer som bruker Gal4/UAS system. Forbigående ekspresjon av denne transgenet resulterte i varierende nivåer av uttrykk, men var vanligvis robust nok til å visualisere både cellen kroppen og aksonal projeksjoner av individuelle nevroner over flere dager. For å optimalisere sensitivligheten til å lyse vi brukte lyset aktiveres kanalen kokk, en channelrhodopsin variant som består av et fantasifoster av channelopsin-1 (Chop1) og channelopsin-2 (Chop2) med en crossover nettsted på helix sløyfe EF 13. Denne kanalen er aktivert på samme bølgelengde som ChR2, men krever lavere lysintensitet for aktivering, noe som gjør den mer følsom enn andre brukte kanaler, inkludert ChR2. Kokken protein ble smeltet sammen til den røde fluorescerende protein, tdTomato, slik at vi kan skjerme for protein expression uten å aktivere kanalen. Som lyskilde, vi brukte en diode pumpet solid state (DPSS) laser koplet til en fiberoptisk kabel for å levere en presis, høyeffekts puls av blått lys til en spesifikk region av larvene. Dette tillater oss å fokusere laserlys på individuelle nevroner, som eliminerer behovet for å finne sjeldne transgene dyr som uttrykker en kanal i enkelt neuron. Ved hjelp av denne tilnærmingen, var vi i stand til å aktivere enkelt RB nevroner, ta atferdsresponsens med en høyhastighets videokamera og bilde de aktiverte nevronene i høy oppløsning med konfokalmikroskopi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens / Material </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Materialer </td></tr><tr><td> Glass Pasteur pipette </td><td> Fisher </td><td> 1367820B </td><td> eller tilsvarende (10-15 mm diameter) </td></tr><tr><td> 200 mikrometer optisk fiber </td><td> ThorLabs </td><td> AFS200/220Y-CUSTOM </td><td> Patch Cord, Lengde: 3 m, Avslutt A: FC / PC, End B: FC / PC, Jakke: FT030 </td></tr><tr><td> 50 mikrometer optisk fiber </td><td> ThorLabs </td><td> AFS50/125Y-CUSTOM </td><td> Patch Cord, Lengde: 3 m, Avslutt A: FC / PC, End B: FC / PC, Jakke: FT030 </td></tr><tr><td> Justerbar Stripping Tool </td><td> ThorLabs </td><td> AFS900 </td><td> eller tre-Hole Stripping Tool (FTS4) </td></tr><tr><td> Diamond Wedge skriver </td><td> ThorLabs </td><td> S90W </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / Brun mikropipette Puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> P-97 </td><td> eller tilsvarende </td></tr><tr><td> Borsilikatglass rør med filament </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF-100-78-10 </td><td></td></tr><tr><td> Injeksjon mold </td><td> n / a </td><td> n / a </td><td> Figur 5 </td></tr><tr><td> 1,5 ml sentrifugerør </td><td> Enhver </td><td> Enhver </td><td></td></tr><tr><td> Petriskål (100x15 mm) </td><td> Enhver </td><td> Enhver </td><td></td></tr><tr><td> Petriskål (60x15 mm) </td><td> Enhver </td><td> Enhver </td><td></td></tr><tr><td> Pressure injektor </td><td> ASI </td><td> MPPI-3 </td><td> eller tilsvarende </td></tr><tr><td> Micromanipulator og metall stativ </td><td> Narashige </td><td> M152 </td><td> eller tilsvarende </td></tr><tr><td> Disponibel plastpipetter </td><td> Fisherbrand </td><td> 13-711-7 </td><td> eller tilsvarende </td></tr><tr><td> Poker (Pin holder and Insect pin) </td><td> Fin Science Tools, Inc. </td><td> 26018-17 og 26000-70 </td><td> eller tilsvarende </td></tr><tr><td> Tang </td><td> Fin Science Tools, Inc. </td><td> 11255-20 </td><td> eller tilsvarende </td></tr><tr><td> Microloader pipettespisser </td><td> Eppendorf </td><td> 9300001007 </td><td></td></tr><tr><td> 28,5 ° C inkubator </td><td> noen </td><td> noen </td><td></td></tr><tr><td> 42 ° C varme-blokk </td><td> Enhver </td><td> Enhver </td><td></td></tr><tr><td> Ikke-steril skalpell blad # 11 </td><td> Fin vitenskapelige verktøy, Inc. </td><td> 10011-00 </td><td> eller tilsvarende </td></tr><tr><td> Dissekere stakle </td><td> Zeiss </td><td> STEMI </td><td> eller tilsvarende </td></tr><tr><td> Fluorescent dissecting omfang med standard filter </td><td> Enhver </td><td> noen </td><td> eller tilsvarende </td></tr><tr><td> Confocal mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> LSM 510 eller 710 </td><td> eller tilsvarende med lasere for GFP og RFP og 10x, 20x og 40x mål </td></tr><tr><td> Høy hastighet kamera </td><td> AOS Technologies, Inc. </td><td> X-PRI (130025-10) </td><td> eller tilsvarende </td></tr><tr><td> 473 nm bærbar laser </td><td> Krystall lasere </td><td> CL-473-050 </td><td> eller høyere makt, med TTL-alternativet </td></tr><tr><td> S48 Stimulator </td><td> Astro-Med, Inc. Grass Instrument divisjon </td><td> S48K </td><td> eller tilsvarende </td></tr><tr><td> FC / PC til FC / PC parring ermet </td><td> ThorLabs </td><td> ADAFC1 </td><td> May need for optisk kabel tilkobling </td></tr><tr><td> Lasersikkerhet Briller </td><td> ThorLabs </td><td> LG10 </td><td> eller tilsvarende </td></tr><tr><td> 24 kultur plater </td><td> Genesee </td><td> 25-102 </td><td> eller tilsvarende </td></tr><tr><td> Enkelt depresjon lysbilder </td><td> Fisher </td><td> S175201 </td><td> Eller tilsvarende </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Instant ocean </td><td> Akvatiske økosystemer </td><td> IS50 </td><td></td></tr><tr><td> Metylenblått </td><td> Fisher </td><td> S71325 </td><td></td></tr><tr><td> Fenolrødt </td><td> Sigma </td><td> P4758 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> EMD </td><td> 2125 </td><td> eller tilsvarende </td></tr><tr><td> Lav Melt agarose </td><td> Sigma </td><td> A9045 </td> &lt;td&gt; eller tilsvarende </td></tr><tr><td> PTU </td><td> Sigma </td><td> P7629 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> Sigma </td><td> A5040 </td><td></td></tr><tr><td> blå / embryo vann </td><td></td><td></td><td> 10 L DDH 2 O 0,6 g Instant Ocean 6 dråper metylenblått </td></tr><tr><td> fenolrødt </td><td></td><td></td><td> (5 mg / ml i 0,2 M KCl) </td></tr><tr><td> 100x PTU </td><td></td><td></td><td> 0,150 g PTU 50 ml DDH 2 O løses opp ved 70 ° C, ryste ofte delmengde og oppbevar ved -20 ° C </td></tr><tr><td> 1x PTU </td><td></td><td></td><td> 1 ml 100x PTU 99 ml blå / fisk vann </td></tr><tr><td> Tricaine stamoppløsningen </td><td></td><td></td><td> 400 mg Tricaine 97,9 DDH 2 O </td></tr><tr><td> ~ 2,1 ml 1M Tris, pH9.0 </td><td></td><td></td> &lt;td&gt; justere pH til ~ 7,0 butikk i 4 ° C eller -20 ° C for langtidslagring </td></tr></tbody></table>

optogenetic activation of zebrafish somatosensory neurons using chef-tdtomato

Larve sebrafisk er fremstår som en modell for å beskrive utvikling og funksjon av enkle nevrale kretser. På grunn av deres ytre befruktning, rask utvikling, og gjennomskinnelighet blir sebrafisk spesielt godt egnet for å undersøke optogenetic tilnærminger nevrale krets funksjon. I denne tilnærmingen, er lys-sensitive ionekanaler uttrykt i bestemte nerveceller, slik at eksperimentator å aktivere eller hemme dem på vilje, og dermed vurdere deres bidrag til spesiell oppførsel. Anvende disse metodene i larve sebrafisk er konseptuelt enkle, men krever optimalisering av tekniske detaljer. Her viser vi en prosedyre for å uttrykke en channelrhodopsin variant i larve sebrafisk somatosensoriske nevroner, foto-aktiverende enkeltceller, og opptak de resulterende atferd. Ved å introdusere noen modifikasjoner til tidligere etablerte metoder, kan denne tilnærmingen brukes til å lokke fram atferdsresponser fra enkle nevroner aktiveres opptil minst 4 dager etter befruktning (DPF). Spesielt har vi opprettet en transgen med en somatosensoriske neuron enhancer, CREST3, for å drive uttrykk for tagget channelrhodopsin variant, kokk-tdTomato. Injisere dette transgenet i 1-celle stadiet embryoer fører mosaikk ekspresjon i somatosensoriske nevroner, som kan avbildes med konfokal mikroskopi. Illuminating identifisert celler hos disse dyrene med lys fra en 473 nm DPSS laser, guidet gjennom en fiberoptisk kabel, utløser atferd som kan tas opp med en high-speed videokamera og analysert kvantitativt. Denne teknikken kan tilpasses til studie atferd elicited ved å aktivere noen sebrafisk neuron. Kombinere denne tilnærmingen med genetiske eller farmakologiske forstyrrelser vil være en effektiv måte å undersøke krets dannelse og funksjon.

<img src="/files/ftp_upload/50184/50184fig1.jpg" alt="Figur 1"/> Figur 1. Optisk kabel satt opp. (A) lagene i en fiberoptisk kabel. (B) Stripped fiberoptisk kabel i en Pasteur pipette. (C) Fiberoptisk kabel i Pasteur pipette posisjonert ved hjelp av en micromanipulator. <img src="/files/ftp_upload/50184/50184fig2.jpg" alt="Figur 2"/> Figur 2. Injeksjon mold mal. <p clas...

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato at JoVE.com

Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

Optogenetic teknikker har gjort det mulig å studere bidraget av spesifikke nerveceller til atferd. Vi beskriver en metode i larve sebrafisk for aktivering enkelt somatosensoriske nevroner uttrykker en channelrhodopsin variant (kokk) med en diode-pumpet solid state (DPSS) laser og registrering av elicited atferd med et høyhastighets videokamera.

Optogenetic Aktivering av sebrafisk somatosensoriske Neurons bruker Chef-tdTomato

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons

Bruk Rimelig LED Arrays for Photo-Stimulering av nerveceller

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selektiv Viral Transduksjon of Adult-fødte olfactory Neurons for Chronic In vivo Optogenetic Stimulering

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

En metode for High Fidelity optogenetic kontroll av enkeltPyramideFormet Neuroner<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Optogenetic Stimulering av hørselsnerven

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Somatosensory Event-related Potentials from Orofacial Skin Stretch Stimulation

Somatosensoriske tilstelninger relaterte Potentials fra Orofacial Skin Stretch Stimulering

Cortical processing associated with orofacial somatosensory function in speech has received limited experimental attention due to the difficulty of ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

Müller Glia celle aktivering i en Laser-indusert Retinal degenerasjon og Regeneration modell i sebrafisk

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging nevrale aktivitet i primære Somatosensory Cortex ved hjelp av Thy1-GCaMP6s transgene mus

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Sporing Drosophila larver atferd som svar til Optogenetic stimulering av Olfactory nerveceller

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Isolasjon og RNA utvinning av Neurons, makrofager og Microglia fra larver sebrafisk hjerner

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...