Name: optogenetic activation of zebrafish somatosensory neurons using chef-tdtomato
Uploaded: 2013-01-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato at JoVE.com

Biz lazer kurmak davranış deneyleri ve DPSS tavsiye için Fumi Kubo, Tod Thiele ve HerwigBaier (UCSF / Max Planck Enstitüsü) thank; şef-tdTomato deneylerinde yardım için MBL Nörobiyoloji Sahası&#39;na Heesoo Kim ve Chiara Cerri; PetronellaKettunen (Göteborg Üniversitesi ) İlk optogenetic deneyler üzerinde işbirliği için; BaljitKhakh, Eric Hudson, Mike Baca ve teknik danışmanlık için John Milligan (UCLA) ve şef-tdTomato için Roger Tsien (UCSD) yaparız. AS: Bu çalışma NSF AMSP ve bir hibe için NRSA (5F31NS064817) ödülü (0.819.010 RIG) tarafından desteklenmiştir.

Vaktinden önce aşağıdaki hazırlayın. 1. Optik Kablo hazırlayın <ol><li> Bir ~ 150 ° açı oluşturmak için bir Bunsen beki üzerine cam Pasteur pipeti ve konik boyun eriterek optik kablo için bir depolama birimi oluşturun. </li><li> Bir tel kesici veya jilet kullanarak, dikkatle iki parçaya optik kabloyu kesti. Her bir parça, bir FC / PC adaptörü ve bir açık uçlu bir ucunu olmalıdır. Bir rezerv kablosu olarak tek parça depolayın. </li><li> Kablosunun kesik ucuna 5.0 ...

<ol>
	<li>Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+zebrafish+behavior+with+halorhodopsin.">Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17968-17973 (2009).</li><li>Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unidirectional+startle+responses+and+disrupted+left-right+co-ordination+of+motor+behaviors+in+robo3+mutant+zebrafish.">Unidirectional startle responses and disrupted left-right co-ordination of motor behaviors in robo3 mutant zebrafish.</a> Genes Brain Behav. 8 (5), 500-511 (2009).</li><li>Douglass, A. D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A. F., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+behavior+elicited+by+single,+channelrhodopsin-2-evoked+spikes+in+zebrafish+somatosensory+neurons.">Escape behavior elicited by single, channelrhodopsin-2-evoked spikes in zebrafish somatosensory neurons.</a> Curr. Biol. 18 (15), 1133-1137 (2008).</li><li>Downes, G. B., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supraspinal+input+is+dispensable+to+generate+glycine-mediated+locomotive+behaviors+in+the+zebrafish+embryo.">Supraspinal input is dispensable to generate glycine-mediated locomotive behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 66 (5), 437-451 (2006).</li><li>Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+locomotor+network+in+zebrafish.">Development of the locomotor network in zebrafish.</a> Prog. Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).</li><li>Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Cell+Extrusion+from+the+Epidermis+of+Developing+Zebrafish.">Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+the+Zebrafish+Embryonic+Brain+by+Confocal+Microscopy.">Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (26), e1217 (2009).</li><li>Kague, E., Weber, C., Fisher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+Zebrafish+Transgenesis+for+Evaluating+Enhancer+Sequences.">Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences.</a> J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+Chimeric+Zebrafish+Embryos+by+Transplantation.">Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (29), e1394 (2009).</li><li>Kohashi, T., Oda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+Mauthner-+or+non-Mauthner-mediated+fast+escape+evoked+by+different+modes+of+sensory+input.">Initiation of Mauthner- or non-Mauthner-mediated fast escape evoked by different modes of sensory input.</a> J. Neurosci. 28 (42), 10641-10653 (2008).</li><li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila.">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat. Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).</li><li>Liao, J. C., Haehnel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+afferent+neurons+in+larval+zebrafish+provides+a+functional+framework+for+lateral+line+somatotopy.">Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy.</a> J. Neurophysiol. 107 (10), 2615-2623 (2012).</li><li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics.">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li><li>Liu, K. S., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablations+reveal+functional+relationships+of+segmental+hindbrain+neurons+in+zebrafish.">Laser ablations reveal functional relationships of segmental hindbrain neurons in zebrafish.</a> Neuron. 23 (2), 325-335 (1999).</li><li>Liu, Y. C., Bailey, I., Hale, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+startle+motor+patterns+and+behaviors+in+the+larval+zebrafish+(Danio+rerio).">Alternative startle motor patterns and behaviors in the larval zebrafish (Danio rerio).</a> J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens Neural. Behav. Physiol. 198 (1), 11-24 (2012).</li><li>Palanca, A. M., Lee, S. L., Yee, L. E., Joe-Wong, C., Trinh, L. A., Hiroyasu, E., Husain, M., Fraser, S. E., Pellegrini, M., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+transgenic+reporters+identify+somatosensory+neuron+subtypes+in+larval+zebrafish.">New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. , (2012).</li><li>Pujol-Mart&#237;, J., Zecca, A., Baudoin, J. P., Faucherre, A., Asakawa, K., Kawakami, K., L&#243;pez-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+birth+order+identifies+a+dimorphic+sensorineural+map.">Neuronal birth order identifies a dimorphic sensorineural map.</a> J. Neurosci. 32 (9), 2976-2987 (2012).</li><li>Saint-Amant, L., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+the+development+of+motor+behaviors+in+the+zebrafish+embryo.">Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).</li><li>Szobota, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+activity+with+a+light-gated+glutamate+receptor.">Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor.</a> Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).</li><li>Uemura, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+functional+genomics+revealed+conservation+and+diversification+of+three+enhancers+of+the+isl1+gene+for+motor+and+sensory+neuron-specific+expression.">Comparative functional genomics revealed conservation and diversification of three enhancers of the isl1 gene for motor and sensory neuron-specific expression.</a> Dev. Biol. 278 (2), 587-606 (2005).</li><li>Wyart, C., Del Bene, F., Warp, E., Scott, E. K., Trauner, D., Baier, H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+dissection+of+a+behavioural+module+in+the+vertebrate+spinal+cord.">Optogenetic dissection of a behavioural module in the vertebrate spinal cord.</a> Nature. 461 (7262), 407-410 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos.">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).</li></ol>

Biz canlı zebrafish tek RB nöronların optogenetic aktivasyonu için bir yaklaşım tarif var. Bizim yöntemi belirli somatosensoriyel nöronların bir floresan etiketli channelrhodopsin varyantı, şef-tdTomato 13, ifade geçici transgenesis kullanır. Bu yaklaşım, kolaylıkla diğer larva zebrafish hücre popülasyonu içinde kullanım için uyarlanabilir. Bu yaklaşımı kullanarak biz sürekli şef-tdTomato ifade 34-48 hpf larva davranışsal tepkilere yol açtı. 5 V mavi...

Işık tanımlanmış dalga boyları ile nöronal uyarılabilirliği teşvik etmek ya da engellemek için optogenetic yöntemlerinin geliştirilmesi mümkün davranışı 1, 19, 21 kontrol nöral devrelerin nöronların farklı toplumlarda fonksiyonu çalışma yapmıştır. Bu teknikten sıklıkla nöron grupları aktive etmek için kullanılır, fakat aynı zamanda tek tek nöron aktive etmek için de kullanılabilir. Yarı saydam olduğundan Zebra balığı larvaları bu yöntemleri için özellikle uygundurlar, onların sinir sistemi hızla gelişir ve transgenik hayvanlar oluşturmak hızlı ve rutin. Ancak, önemli teknik engeller güvenilir tek bir nöron aktivasyon ulaşmak için aşılması gereken. Tek zebrafish nöronların optogenetic aktivasyonu için bir prosedür optimize etmek için, biz somatosensoriyel nöronlar üzerinde duruldu. Kafa innerve trigeminal nöronlar ve Rohon-Sakal (: Zebra balığı larvaları iki nöron popülasyonları kullanarak somato çeşitli uyaranlara algılamakVücudun geri kalan innerve RB) nöronları,. Her trigeminal ve RB nöron deride yaygın şube uyaranlara ve downstream nöral devreleri bağlanır merkezi bir akson algılamak için bir periferik akson hedefleniyor. Hayvanlar bu tutarlı somatosensoryel devreleri, 18 5 oluşturdular gösteren, erken saat sonrası fertilizasyon (HPF) 21 olarak dokunmaya tepki. Larval gelişim süresince en az MAUTHNER hücrenin üzerine bazı trigeminal ve RB nöronlar sinaps, klasik kaçış yanıtı aktive ama delil biriken kaçış davranışının 2, 4 varyasyonlarını aydınlatır bağlantı farklı desenleri ile somato nöronların birden fazla sınıflar olduğunu göstermektedir etmek 10, 12, 14, 15, 16, 17. Bu yöntem geliştirilmesine Bizim motivasyon somato nöronların farklı sınıfların davranış işlevini karakterize etmek için, ama bu yaklaşım ilke lar nöronların hemen her nöron veya nüfus fonksiyonunu incelemek için kullanılabilirval zebrafish. Douglass ve ark. Önceden aktive etmek için bir yöntem tarif Channelrhodopsin-2-eksprese eden, mavi ışık ile somatosensoriel nöronların kaçış davranışının 3 ortaya çıkarmak. Onların yaklaşımı somatosensoriyel nöronlarda ChR2-EYFP ifade sürücü isl1 geni bir artırıcı elemanı kullanılmalıdır. Bu, transgen, ancak, bir ikinci haberci bir birlikte-enjeksiyon gerektiren, nispeten zayıf floresan göstermek için rapor edildi, UAS :: GFP, ChR2-EYFP salgılayan hücrelerin görüntülenmesine izin verir. Bu yaklaşım 24-48 hpf arasındaki davranış tepkiler için kullanılan, ancak 72 hpf geçmişte bir yanıt ortaya çıkarmak asla. Bu yöntem çok erken larva dönemleri (24-48 hpf) de sinir devresi eğitim için çalışıyor iken Böylece, daha farklı davranışsal tepkiler görülür ve nöral devrelerin daha olgun yaşlı larvaları, nöral devreleri ve davranışsal tepkileri tanımlamak için yetersizdir. Biz çalıştılarva RB nöronların alt popülasyonlarının işlevini karakterize etmek amacıyla bu tekniğin duyarlılık geliştirmek. Ifadesi iyileştirmek için bir floresan etiketli ışık aktif kanal ifadesi yükseltmek için lexA-VP16 ifade ve lexA operatör dizileri (4xLexAop) 11 bir streç sürmek için bir somatosensoriyel özgü artırıcı (CREST3) 20 kullanılır. Bu yapılandırma, ikinci bir muhabir co-ifade ve bize doğrudan her nöronda kanalın göreceli bolluk belirlemek için izin için ihtiyacı ortadan kaldırarak, kanalı ifade güçlendirilmiş. Lexa / LexAop dizisi kullanarak bize Gal4/UAS sistemi kullanmak zebrafish muhabiri satırlara transgen tanıtmak için izin ek avantajı vardı. Bu transgen Geçici ifade ifade düzeylerde sonuçlandı, ancak genellikle birkaç gün içinde hücre gövdesi ve bireysel nöronların akson projeksiyonları görselleştirmek için yeterince güçlüydü. Duyarl optimize etmekışığa Sığ biz kanal Chef, sarmal döngü EF 13 yaşında bir crossover site ile channelopsin-1 (Chop1) ve channelopsin-2 (Chop2) bir chimera oluşan channelrhodopsin türevi aktive ışık kullanılır. Bu kanal ChR2 gibi aynı dalga boyunda aktive, fakat ChR2 de dahil olmak üzere diğer yaygın olarak kullanılan kanal, daha daha duyarlı hale aktivasyonu için düşük bir ışık yoğunluğu gerektirir. Chef proteini bize kanal aktive olmadan protein ekspresyonu için ekran sağlayan kırmızı floresan proteini, tdTomato erimiş oldu. Bir ışık kaynağı olarak, bir diyot larvaları belirli bir bölgeye mavi bir ışık hassas, yüksek-enerjili darbe sunmak için bir fiber optik kablo birleştiğinde katı-hal (DPSS) lazer pompalanır kullanılır. Bu bize tek bir nöron kanalı ifade nadir transgenik hayvanlar bulmak için ihtiyacı ortadan kaldırarak, bireysel nöronların üzerine lazer ışığı odaklamak için izin verdi. Bu yaklaşımı kullanarak, biz, tek RB nöronlar aktive davranışsal tepkisi kaydetmek başardıkyüksek hızlı video kamera ve resim konfokal mikroskopi ile yüksek çözünürlükte aktive nöron s.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Malzeme Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Malzemeler </td></tr><tr><td> Cam Pasteur pipeti </td><td> Balıkçı </td><td> 1367820B </td><td> veya eşdeğeri (10-15 mm çap) </td></tr><tr><td> 200 mikron fiber optik </td><td> ThorLabs </td><td> AFS200/220Y-CUSTOM </td><td> Patch Cord, Uzunluk: 3 m, End A: FC / PC, End B: FC / PC, Ceket: FT030 </td></tr><tr><td> 50 mikron fiber optik </td><td> ThorLabs </td><td> AFS50/125Y-CUSTOM </td><td> Patch Cord, Uzunluk: 3 m, End A: FC / PC, End B: FC / PC, Ceket: FT030 </td></tr><tr><td> Ayarlanabilir sıyırma aleti </td><td> ThorLabs </td><td> AFS900 </td><td> veya Üç Delik sıyırma aleti (FTS4) </td></tr><tr><td> Diamond Wedge kâtip </td><td> ThorLabs </td><td> S90W </td><td></td></tr><tr><td> / Brown Mikropipet Çektirme Flaming </td><td> Sutter Aletleri </td><td> P-97 </td><td> ya da denk </td></tr><tr><td> Filament ile borosilikat cam tüp </td><td> Sutter Aletleri </td><td> BF-100-78-10 </td><td></td></tr><tr><td> Enjeksiyon kalıp </td><td> n / a </td><td> n / a </td><td> Şekil 5, </td></tr><tr><td> 1.5 ml santrifüj tüplerine </td><td> Herhangi </td><td> Herhangi </td><td></td></tr><tr><td> Petri kabı (100x15 mm) </td><td> Herhangi </td><td> Herhangi </td><td></td></tr><tr><td> Petri kabı (60X15 mm) </td><td> Herhangi </td><td> Herhangi </td><td></td></tr><tr><td> Basınç enjektör </td><td> ASI </td><td> MPPI-3 </td><td> ya da denk </td></tr><tr><td> Mikromanipülatör ve metal stand </td><td> Narashige </td><td> M152 </td><td> ya da denk </td></tr><tr><td> Tek kullanımlık plastik pipetler </td><td> Fisherbrand </td><td> 13-711-7 </td><td> ya da denk </td></tr><tr><td> Poker (Pin tutucu ve Böcek pin) </td><td> Güzel Bilim Araçları, Inc </td><td> 26018-17 ve 26000-70 </td><td> ya da denk </td></tr><tr><td> Forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları, Inc </td><td> 11255-20 </td><td> ya da denk </td></tr><tr><td> Microloader pipet uçları </td><td> Eppendorf </td><td> 9300001007 </td><td></td></tr><tr><td> 28.5 ° C inkübatör </td><td> herhangi </td><td> herhangi </td><td></td></tr><tr><td> 42 ° C ısı bloğu </td><td> Herhangi </td><td> Herhangi </td><td></td></tr><tr><td> Non-Steril neşter bıçakları # 11 </td><td> Güzel Bilimsel Araçları, Inc </td><td> 10011-00 </td><td> ya da denk </td></tr><tr><td> S Diseksiyonbaşa çıkmak </td><td> Zeiss </td><td> Stemi </td><td> ya da denk </td></tr><tr><td> Standart filtre ile Floresan diseksiyon kapsamı </td><td> Herhangi </td><td> herhangi </td><td> ya da denk </td></tr><tr><td> Konfokal mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> LSM 510 veya 710 </td><td> veya GFP ve RFP için lazerler ile eşdeğer ve 10x, 20x ve 40x hedefleri </td></tr><tr><td> Yüksek hızlı kamera </td><td> AOS Technologies, Inc </td><td> X-PRI (130025-10) </td><td> ya da denk </td></tr><tr><td> 473 nm taşınabilir lazer </td><td> Kristal lazerler </td><td> CL-473-050 </td><td> TTL seçeneği ile ya da yüksek güç, </td></tr><tr><td> S48 Stimülatör </td><td> Astro-Med, Inc Çim Enstrüman bölümü </td><td> S48K </td><td> ya da denk </td></tr><tr><td> FC / PC çiftleşme kol FC / PC </td><td> ThorLabs </td><td> ADAFC1 </td><td> Mayıs neoptik kablo bağlantısı için ed </td></tr><tr><td> Lazer Güvenlik Gözlükleri </td><td> ThorLabs </td><td> LG10 </td><td> ya da denk </td></tr><tr><td> 24 kültür plakaları </td><td> Genesee </td><td> 25-102 </td><td> ya da denk </td></tr><tr><td> Tek depresyon slaytlar </td><td> Balıkçı </td><td> S175201 </td><td> Veya eşdeğeri </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reaktif </td></tr><tr><td> Anında okyanus </td><td> Sucul Ekosistemler </td><td> IS50 </td><td></td></tr><tr><td> Metilen mavisi </td><td> Balıkçı </td><td> S71325 </td><td></td></tr><tr><td> Fenol kırmızı </td><td> Sigma </td><td> P4758 </td><td></td></tr><tr><td> Agaroz </td><td> EMD </td><td> 2125 </td><td> ya da denk </td></tr><tr><td> Düşük Erime agaroz </td><td> Sigma </td><td> A9045 </td> &lt;td&gt; veya eşdeğeri </td></tr><tr><td> PTU </td><td> Sigma </td><td> P7629 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> Sigma </td><td> A5040 </td><td></td></tr><tr><td> mavi / embriyo su </td><td></td><td></td><td> 10 L GKD 2 O 0.6 gr Instant Ocean 6 damla metilen mavisi </td></tr><tr><td> fenol kırmızısı </td><td></td><td></td><td> (0.2 M KCl içinde 5 mg / ml) </td></tr><tr><td> 100x PTU </td><td></td><td></td><td> 0.150 g PTU 50 ml GKD 2 O 70 ° C&#39;de erime, sık sık sallamak -20 ° C de tablet ve mağaza </td></tr><tr><td> 1x PTU </td><td></td><td></td><td> 1 ml 100x PTU 99 ml mavi / balık suyu </td></tr><tr><td> Tricaine stok solüsyonu </td><td></td><td></td><td> 400 mg tricaine 97.9 GKD 2 O </td></tr><tr><td> ~ 2.1 ml 1M Tris pH9.0 </td><td></td><td></td> &lt;td&gt; ~ 7.0 pH ayarı Uzun süreli depolama için 4 ° C veya -20 ° C&#39;de saklayın </td></tr></tbody></table>

optogenetic activation of zebrafish somatosensory neurons using chef-tdtomato

Larva zebrafish basit nöral devrelerin gelişimi ve işlevi açıklayan bir model olarak ortaya çıkmaktadır. Dış döllenme, hızlı bir gelişme ve translucency nedeniyle, zebrafish özellikle nöral devre fonksiyonu araştırmak optogenetic yaklaşımlar için uygundur. Bu yaklaşımda, ışığa duyarlı iyon kanallarının açılıp inhibe bunları iradesi ve böylece belirli davranışları katkılarını değerlendirmek için deneyci sağlayan, belirli nöronlar olarak ifade edilmiştir. Larva zebrafish bu yöntemlerin uygulanması kavramsal olarak basit ama teknik detay optimizasyon gerektirir. Burada larva zebrafish somatosensoryel nöronlar, foto-aktive tek hücreler, bir channelrhodopsin varyantı ifade ve ortaya çıkan davranışları kaydetmek için bir yordam göstermek. Önceden kurulmuş yöntemleri için birkaç değişiklik tanıştırarak, bu yaklaşım kadar aktif tek nöronların davranışsal tepkiler için kullanılan olabiliren az 4 gün sonrası dölleme (dpf). Özellikle, biz tagged channelrhodopsin varyant, Chef-tdTomato ifade sürmek için bir somatosensoryel nöron artırıcı, CREST3, kullanarak bir transgen yarattı. Konfokal mikroskopi ile görüntülenebilir somatosensoriyel nöronlarda mozaik ifade, 1-hücreli dönem embriyoların sonuçları içine bu transgen enjekte. Aydınlatıcı, bir 473 nm DPSS lazer ışığı ile bu hayvanların hücreleri tanımlanan bir fiber optik kablo aracılığıyla rehberlik, yüksek hızlı bir video kamera ile kaydedilmiş ve kantitatif analiz edilebilir davranışları ortaya çıkarır. Bu teknik, herhangi zebrafish nöron aktive tarafından ortaya çıkarılan çalışma davranışlarına adapte olabilir. Genetik ya da farmakolojik tedirginlikler bu yaklaşımı birleştiren devre oluşumu ve işlevi araştırmak için güçlü bir yol olacaktır.

<img src="/files/ftp_upload/50184/50184fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. Optik kablo kurmak. Fiber optik kablo (A) Katmanlar. Pasteur pipeti (B) Stripped fiber optik kablo. (C) Pasteur pipeti Fiber optik kablo mikromanipülatör kullanılarak yerleştirilir. <img src="/files/ftp_upload/50184/50184fig2.jpg" alt="Şekil 2,"/> Şekil 2. Enjeksiyon kalıp şablonu. <p cl...

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato at JoVE.com

Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

Optogenetic teknikleri mümkün davranışına özgü nöronların katkısı çalışma yaptık. Biz bir diyot pompalı katı hal (DPSS) lazer ile channelrhodopsin varyant (şef) ifade ve yüksek hızlı video kamera ile ortaya çıkardı davranışların kaydedilmesi tek somatosensoriyel nöronlar aktive larva zebrafish bir yöntem açıklanmaktadır.

Chef-tdTomato kullanarak Zebrafish Somatosensoriyel Nöron Optogenetic Etkinleştirme

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

Kombine Kullanımı Hedefleme Koku Ampul Nöronlar In Vivo Elektroporasyon ve Gal4 Tabanlı Enhancer Trap Zebra balığı Hatları

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons

Nöronlar Foto-Stimülasyon için uygun fiyatlı LED Diziler

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Kronik Yetişkin doğmuş Koku Nöronlar Seçici Viral İletimi In vivo Optogenetic Uyarım

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Bireysel piramidal nöronlar High Fidelity optogenetic Kontrolü için Bir Yöntem<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

İşitsel Sinir optogenetic uyarılması

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Somatosensory Event-related Potentials from Orofacial Skin Stretch Stimulation

Orofasial Cilt Streç Uyarım gelen somatosensorial Olay ile ilgili Potansiyeller

Cortical processing associated with orofacial somatosensory function in speech has received limited experimental attention due to the difficulty of ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

Bir lazer kaynaklı retina dejenerasyonu, Zebra balığı rejenerasyon modelini Müller Glia hücre aktivasyonu

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Sinirsel aktivite Thy1kullanarak birincil somatosensor kortekste Imaging-GCaMP6s transgenik fareler

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Yanıt koku nöronlar Optogenetic uyarılması olarak Drosophila larva davranışını izlemek

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Yalıtım ve RNA çıkarma larva Zebra balığı beyin sinir hücreleri, makrofajlar ve Microglia

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...