Name: na&iuml;ve adult stem cells isolation from primary human fibroblast cultures
Uploaded: 2013-05-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about NaÃ¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures Video at JoVE.com

وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة الكسندر فون همبولت (5090371)، ومركز KUHNE كريستين لأبحاث أمراض الحساسية والتعليم (CK-CARE)، وBayerischen Staatsministerium (دينار كويتي).

1. عزل SKP من الثقافات الليفية الابتدائية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتم المحافظة على الثقافات الليفية إما من بنوك الخلايا أو الحصول عليها مباشرة من خزعات الجلد في الثقافة في الخلايا الليفية النمو المتوسطة DMEM تحتوي على 15٪ مصل العجل الجنين، 2 مم ا?...

<ol>
	<li>Jahoda, C. A., Whitehouse, J., Reynolds, A. J., Hole, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+follicle+dermal+cells+differentiate+into+adipogenic+and+osteogenic+lineages.">Hair follicle dermal cells differentiate into adipogenic and osteogenic lineages.</a> Exp. Dermatol. 12, 849 (2003).</li><li>Watt, F. M., Celso, L. o., C, V., Silva-Vargas, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+stem+cells:+an+update.">Epidermal stem cells: an update.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 16, 518 (2006).</li><li>Blanpain, C., Horsley, V., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+stem+cells:+turning+over+new+leaves.">Epithelial stem cells: turning over new leaves.</a> Cell. 128, 445 (2007).</li><li>Hunt, D. P., Jahoda, C., Chandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+skin-derived+precursors:+from+biology+to+clinical+translation.">Multipotent skin-derived precursors: from biology to clinical translation.</a> Vurr. Opin. Biotechnol. 20, 522 (2009).</li><li>Toma, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+multipotent+adult+stem+cells+from+the+dermis+of+mammalian+skin.">Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin.</a> Nat. Cell Biol. 3, 778 (2001).</li><li>Fernandes, K. J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dermal+niche+for+multipotent+adult+skin-derived+precursor+cells.">A dermal niche for multipotent adult skin-derived precursor cells.</a> Nat. Cell Biol. 6, 1082 (2004).</li><li>Wenzel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na&#239;ve+adult+stem+cells+from+patients+with+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+express+low+levels+of+progerin+in+vivo.">Na&#239;ve adult stem cells from patients with Hutchinson-Gilford progeria syndrome express low levels of progerin in vivo.</a> Bio. Open. 1, (2012).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25, 402 (2001).</li><li>Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. T., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skin-derived+precursors+(SKPs)+and+differentiation+and+enrichment+of+their+Schwann+cell+progeny.">Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny.</a> Nature Protocol. 1, 2803 (2006).</li><li>Toma, J. G., McKenzie, I., Bagli, D., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+multipotent+skin-derived+precursors+from+human+skin.">Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin.</a> Stem Cells. 23, 727 (2005).</li><li>Fernandes, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+neurogenic+potential+of+multipotent+skin-derived+precursors.">Analysis of the neurogenic potential of multipotent skin-derived precursors.</a> Electrophoresis. 201, 32 (2006).</li><li>Hill, l. K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+vascular+progenitor+cells+capable+of+endothelial+and+smooth+muscle+cell+function.">Human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells capable of endothelial and smooth muscle cell function.</a> Exp. Hematol. 38, 246 (2010).</li></ol>

باستخدام الطريقة الموصوفة هنا، السذاجة الخلايا الجذعية عن طريق الجلد يمكن عزلها عن الثقافات الخلايا الليفية الجلدية الأولية. باستخدام هذا النهج، ونحن ذكرت مؤخرا عزل وتوصيف الخلايا الجذعية البالغة من الثقافات الليفية المستمدة من المرضى الذين يعانون من متلازمة ورا?...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31966-047</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21885-108</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>Final conc.: 200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/ Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin solution (0.25%)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12 Nutrient Mixture (Ham)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21765-029</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>4114-TC-01M</td>
			<td>Final conc.: 40 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>Final conc.: 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFBB</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHG0043</td>
			<td>Final conc.: 5 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-b1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHG9204</td>
			<td>Final conc.: 2.5 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 flask</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>FALC353109</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS w/o CaMg</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-169</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8388.2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vector Inc.</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Minikit</td>
			<td>Qiagen, Valencia, CA</td>
			<td>74104</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omniscript Reverse Transcriptase</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205113</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast EvaGreen Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>172-5201</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15290-018</td>
			<td>Final conc.:1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 2. Specific reagents and equipment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

na&iuml;ve adult stem cells isolation from primary human fibroblast cultures

على مدى العقد الماضي، وقد تم تحديد العديد من السكان الكبار الخلايا الجذعية في الجلد البشري 1-4. وذكرت والعزلة السلائف متعددة القدرات الجلدي الكبار أول مرة من قبل ميلر F. D مختبر 5، 6. وصف هذه الدراسات في وقت مبكر متعددة القدرات خلية السكان السلائف من الكبار الأدمة الثدييات 5. هذه الخلايا - SKPs يطلق عليه، لالسلائف الجلد المشتقة - تم عزل وتوسيع نطاقها من القوارض وجلد الإنسان ومتباينة في ذرية على حد سواء العصبي وأرومية متوسطة، بما في ذلك أنواع الخلايا أبدا وجدت في الجلد، مثل الخلايا العصبية 5. كشفت الدراسات Immunocytochemical على SKPs مثقف أن الخلايا أعرب vimentin وnestin، وهو بروتين خيوط الوسيطة التي أعرب عنها في السلائف العضلات العصبي والهيكل العظمي، بالإضافة إلى فبرونيكتين ومتعددة القدرات علامات الخلايا الجذعية 6. حتى الآن، وقد تم عزل الخلايا الجذعية البالغة SKPs السكان من جمعها طازجة خزعات الجلد الثدييات. ve_content &quot;&gt; في الآونة الأخيرة، وقد أنشأنا وذكرت أن عدد سكانها خلايا الجلد السلائف المستمدة يمكن أن تظل موجودة في الثقافات الليفية الأولية التي أنشئت من خزعات الجلد 7. وكان الافتراض أن عدد قليل من الخلايا الجذعية الجسدية قد تتواجد في الثقافات الليفية الأولية في الأضعاف السكان في وقت مبكر بالاستناد إلى الملاحظات التالية: (1) يتم اشتقاق SKPs والثقافات الليفية الأولية من الأدمة، ويمكن أن تظل موجودة في الثقافات الخلايا الليفية الجلدية الأولية وبالتالي عدد قليل من الخلايا SKP و (2) الثقافات الليفية الأولية نمت من مأخوذة المجمدة التي كانت تعرض لدرجة حرارة غير المواتية أثناء التخزين أو النقل يحتوي على عدد صغير من الخلايا التي ظلت قابلة للحياة 7. هذه الخلايا النادرة كانوا قادرين على توسيع ويمكن passaged عدة مرات. اقترح هذه الملاحظة أن عددا صغيرا من الخلايا مع ارتفاع قوة الانتشار ومقاومة للإجهاد كانت موجودة في الثقافات الخلايا الليفية الإنسان 7. ونحن قد استفادت من تلك النتائج إلى وضع بروتوكول لعزل السريع للخلايا الجذعية البالغة من الثقافات الليفية الأولية التي تتوافر بسهولة من بنوك الأنسجة في جميع أنحاء العالم (الشكل 1). هذا الأسلوب له أهمية كبيرة لأنه يتيح للعزل الخلايا السلائف عندما عينات الجلد لا يمكن الوصول إليها في حين الثقافات الليفية قد تكون متاحة من بنوك الأنسجة، وبالتالي، وفتح فرص جديدة لتشريح الآليات الجزيئية الكامنة وراء الأمراض الوراثية النادرة فضلا عن الأمراض النمذجة في طبق.

وتبين لنا أن عدد السكان من الخلايا التي تعمل على توسيع انتقائي لتوليد المجالات SKP تحت ظروف النمو للرقابة تتكون من صندوق تعديل العولمة الأوروبي وFGF2 موجودة في الثقافات الخلايا الليفية الجلدية الأولية (الشكل 1) كما ذكرنا مؤخرا 7. <p class="jove_content" style=";text-align:r...

Watch this Scientific Journal Video about NaÃ¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures Video at JoVE.com

NaÃ¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures Video (Video) | JoVE

نفيدكم طريقة لعزل السذاجة السلائف الجلد المشتقة (SKP) خلايا متعددة القدرات من الثقافات الخلايا الليفية الإنسان الأساسية. وتبين لنا أن هذه SKPs المستمدة من الثقافات الليفية تقاسم خصائص الخلايا الجذعية مماثلة لتلك التي تستمد مباشرة من خزعات الجلد البشري. هذه الخلايا تعبر عن علامة قمة العصبية، nestin، بالإضافة إلى علامات متعددة القدرات مثل OCT4 وNANOG.

السذاجة الكبار الخلايا الجذعية عزل من المرحلة الابتدائية الثقافات الخلايا الليفية الإنسان

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Research

JoVE Journal

Biology

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells Video (Video) | JoVE

العزلة وتوقعات بنمو كبير من الكبار الإنسان خلايا غشائي السلف تشكيل مستعمرة

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents Video (Video) | JoVE

إنشاء الابتدائية الثقافات الليفية الكبار من القوارض

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts Video (Video) | JoVE

عزل الخلايا الجذعية من الإنسان Xenografts سرطان البنكرياس

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos Video (Video) | JoVE

الخلية الأولية من الثقافات ذبابة الفاكهة الأجنة المعيدة

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin Video (Video) | JoVE

العزلة وثقافة الكبار الخلايا الجذعية الظهارية من الجلد البشري

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts Video (Video) | JoVE

اختيار وعزل المستعمرات من صنع الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة برمجتها من الخلايا الليفية الكبار

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells Video (Video) | JoVE

إعداد خلايا الفأر الجنينية الخلايا الليفية مناسبة للالإنسان التثقيف الجنينية والتي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures Video (Video) | JoVE

إزالة الخلايا الليفية السريع من الكثافة البشرية العالية الجنينية الخلايا الجذعية الثقافات

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolation and Culture of Myofibers and their Satellite Cells | Protocol (Video) | JoVE

العزلة وثقافة فردية وMyofibers زنزاناتهم القمر الصناعي من العضلات الهيكلية الكبار

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates Video (Video) | JoVE

عزل الخلايا الجذعية من دليل الدهنية المشتقة من Lipoaspirates الإنسان

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...