Name: na&iuml;ve adult stem cells isolation from primary human fibroblast cultures
Uploaded: 2013-05-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about NaÃ¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures Video at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי קרן אלכסנדר פון הומבולדט (5090371), המרכז לחקר כריסטין Kühne אלרגיה וחינוך (CK-CARE), וStaatsministerium Bayerischen (לKD).

1. בידוד SKP מתרבויות פיברובלסטים הראשוניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבויות פיברובלסטים או מבנקים או תאים המתקבלים ישירות מביופסיות עור נשמרות בתרבות בפיברובלסטים צמיחת מדיום DMEM המכיל 15% עוברי עגל בסרום, גלוטמין 2 מ&quot;מ, 10 מ&quot;ג / מיליליטר פני...

<ol>
	<li>Jahoda, C. A., Whitehouse, J., Reynolds, A. J., Hole, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+follicle+dermal+cells+differentiate+into+adipogenic+and+osteogenic+lineages.">Hair follicle dermal cells differentiate into adipogenic and osteogenic lineages.</a> Exp. Dermatol. 12, 849 (2003).</li><li>Watt, F. M., Celso, L. o., C, V., Silva-Vargas, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+stem+cells:+an+update.">Epidermal stem cells: an update.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 16, 518 (2006).</li><li>Blanpain, C., Horsley, V., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+stem+cells:+turning+over+new+leaves.">Epithelial stem cells: turning over new leaves.</a> Cell. 128, 445 (2007).</li><li>Hunt, D. P., Jahoda, C., Chandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+skin-derived+precursors:+from+biology+to+clinical+translation.">Multipotent skin-derived precursors: from biology to clinical translation.</a> Vurr. Opin. Biotechnol. 20, 522 (2009).</li><li>Toma, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+multipotent+adult+stem+cells+from+the+dermis+of+mammalian+skin.">Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin.</a> Nat. Cell Biol. 3, 778 (2001).</li><li>Fernandes, K. J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dermal+niche+for+multipotent+adult+skin-derived+precursor+cells.">A dermal niche for multipotent adult skin-derived precursor cells.</a> Nat. Cell Biol. 6, 1082 (2004).</li><li>Wenzel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na&#239;ve+adult+stem+cells+from+patients+with+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+express+low+levels+of+progerin+in+vivo.">Na&#239;ve adult stem cells from patients with Hutchinson-Gilford progeria syndrome express low levels of progerin in vivo.</a> Bio. Open. 1, (2012).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25, 402 (2001).</li><li>Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. T., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skin-derived+precursors+(SKPs)+and+differentiation+and+enrichment+of+their+Schwann+cell+progeny.">Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny.</a> Nature Protocol. 1, 2803 (2006).</li><li>Toma, J. G., McKenzie, I., Bagli, D., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+multipotent+skin-derived+precursors+from+human+skin.">Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin.</a> Stem Cells. 23, 727 (2005).</li><li>Fernandes, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+neurogenic+potential+of+multipotent+skin-derived+precursors.">Analysis of the neurogenic potential of multipotent skin-derived precursors.</a> Electrophoresis. 201, 32 (2006).</li><li>Hill, l. K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+vascular+progenitor+cells+capable+of+endothelial+and+smooth+muscle+cell+function.">Human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells capable of endothelial and smooth muscle cell function.</a> Exp. Hematol. 38, 246 (2010).</li></ol>

שימוש בשיטה המתוארת במסמך זה, ניתן לבודד תאי גזע עורי נאיבי מתרבויות פיברובלסטים עורי ראשוני. שימוש בגישה זו, לאחרונה דיווחו בידוד והאפיון של תאי גזע בוגרים מתרבויות פיברובלסטים שמקורם בחולים עם תסמונת גנטית נדירה, האצ&#39;ינסון-גילפורד progeria תסמונת 7. כמו להראות ...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31966-047</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21885-108</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>Final conc.: 200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/ Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin solution (0.25%)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12 Nutrient Mixture (Ham)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21765-029</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>4114-TC-01M</td>
			<td>Final conc.: 40 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>Final conc.: 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFBB</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHG0043</td>
			<td>Final conc.: 5 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-b1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHG9204</td>
			<td>Final conc.: 2.5 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 flask</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>FALC353109</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS w/o CaMg</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-169</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8388.2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vector Inc.</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Minikit</td>
			<td>Qiagen, Valencia, CA</td>
			<td>74104</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omniscript Reverse Transcriptase</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205113</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast EvaGreen Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>172-5201</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15290-018</td>
			<td>Final conc.:1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 2. Specific reagents and equipment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

na&iuml;ve adult stem cells isolation from primary human fibroblast cultures

במהלך העשור האחרון, מספר אוכלוסיות תאי גזע בוגרים זוהו בעור אנושי 1-4. הבידוד של מבשרי עור מבוגרים multipotent דווח לראשונה על ידי מילר פ D מעבדה 5, 6. מחקרים המוקדמים אלה תאר אוכלוסיית תאי מבשר multipotent מהדרמיס יונקים בוגרים 5. תאים אלה - SKPs כינה, למבשרי עור נגזרים - היו מבודדים והתרחבו ממכרסמים ועור אנושי ומובחן לצאצאים הן עצביים וmesodermal, כולל סוגי תאים לא נמצאו בעור, כגון תאי עצב 5. מחקרי immunocytochemical על SKPs תרבית גילו כי תאים הביעו vimentin וnestin, חלבון נימה ביניים באו לידי ביטוי בשרירי מבשרי עצבים ושלד, בנוסף לפיברונקטין וסמני תאי גזע multipotent 6. עד עכשיו, את SKPs אוכלוסיית תאי גזע הבוגרים היו מבודד מביופסיות עור יונקים טריים שנאספו. ve_content &quot;&gt; לאחרונה, הקמנו ודיווחתי כי אוכלוסייה של תאים מבשר נגזרים עור יכולה להישאר קיימת בתרבויות פיברובלסטים ראשוניות שנקבעו מביופסיות עור 7. ההנחה שכמה תאי גזע הסומטיים אולי מתגוררים בתרבויות פיברובלסטים ראשוניות באוכלוסיית הכפלות הייתה מוקדמות בהתבסס על תצפיות אלה: (1) SKPs ותרבויות פיברובלסטים העיקריות נגזרים מדרמיס, ולכן מספר קטן של תאי SKP יכול להישאר קיים בתרבויות פיברובלסטים עורי הראשוני ו( 2) תרבויות פיברובלסטים ראשוניות גדלו מ aliquots הקפוא שהיו נתון שלילי הטמפרטורה במהלך אחסון או ההעברה הכיל מספר קטן של תאים שנותרו קיימא 7. תאים נדירים אלה היו מסוגלים להרחיב ואפשר היה passaged מספר פעמים. תצפית זו הציעה כי מספר קטן של תאים עם עוצמה התפשטות גבוהה והתנגדות ללחץ היו קיימים בתרבויות האנושיות פיברובלסטים 7. אנחנו ניצל את הממצאים אלה להקמת פרוטוקול לבידוד מהיר של תאי גזע בוגרים מתרבויות פיברובלסטים העיקריות הזמינים בקלות מבנקי רקמות ברחבי העולם (איור 1). לשיטה זו משמעות חשובה שכן היא מאפשרת בידוד של תאים מבשר כאשר דגימות עור אינן נגישים תוך תרבויות פיברובלסטים עשויות להיות זמינות מבנקי רקמות, ובכך, פותחות הזדמנויות חדשות לנתח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס מחלות גנטיות נדירות כמו גם מחלות בדוגמנות מנה.

אנו מראים כי אוכלוסייה של תאים באופן סלקטיבי כדי ליצור הרחבת תחומי SKP בתנאי גידול מבוקרים בהיקף של EGF וFGF2 קיים בתרבויות פיברובלסטים עורי ראשוני (איור 1) כפי שדיווחנו לאחרונה 7. תרבויות פיברובלסטים מקובצי PPD 15 עד 25, כי ...

Watch this Scientific Journal Video about NaÃ¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures Video at JoVE.com

NaÃ¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures Video (Video) | JoVE

אנו מדווחים על שיטה לבודד מבשר עור נגזרות נאיביים multipotent (SKP) תאים פיברובלסטים מתרבויות האנושיות העיקריות. אנו מראים כי SKPs אלה נגזרים מתרבויות פיברובלסטים חולקים מאפיינים של תאי גזע דומים לאלה שנגזרים ישירות מביופסיות עור אדם. תאים אלה מבטאים את סמן הרכס העצבי, nestin, בנוסף לסמני multipotent כגון Oct4 וNanog.

בידוד תאי גזע בוגרים נאיבי מתרבויות פיברובלסטים אנושיות הראשוניות

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Research

JoVE Journal

Biology

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells Video (Video) | JoVE

בידוד הרחבת בקנה מידה גדול של תאים אנושיים למבוגרים האנדותל המושבה יצירת אב

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents Video (Video) | JoVE

הקמת ראשיים פיברובלסטים תרבויות למבוגרים מאת מכרסמים

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts Video (Video) | JoVE

בידוד של בתאי גזע xenografts סרטן הלבלב האנושי

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos Video (Video) | JoVE

תא תרבויות ראשי מ תסיסנית Gastrula עוברים

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin Video (Video) | JoVE

בידוד תרבות למבוגרים גזע תאים אפיתל של העור האנושי

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts Video (Video) | JoVE

בחירה בידוד מושבות של בתאי גזע pluripotent מושרה לתכנות מחדש של Fibroblasts למבוגרים

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells Video (Video) | JoVE

הכנת עובריים של עכברים תאים פיברובלסטים מתאים האדם culturing תאים עובריים pluripotent המושרה בתאי גזע

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures Video (Video) | JoVE

הסרת פיברובלסטים מהירה מתרבויות צפיפות גבוהות אדם תאי גזע עובריות

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolation and Culture of Myofibers and their Satellite Cells | Protocol (Video) | JoVE

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates Video (Video) | JoVE

בידוד ידני של תאי גזע שמקורם בשומן מLipoaspirates האדם

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...