Name: na&iuml;ve adult stem cells isolation from primary human fibroblast cultures
Uploaded: 2013-05-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about NaÃ¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures Video at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Alexander von Humboldt Foundation (5090371), den Christine Kühne Center for Allergy forskning og utdanning (CK-CARE), og Bayerischen Staatsministerium (til KD).

En. SKP Isolasjon fra Primær fibroblastkulturer <ol><li> Fibroblastkulturer enten fra celle banker eller direkte oppnådd fra hud biopsier blir opprettholdt i kultur i fibroblastvekstfaktor medium DMEM inneholdende 15% føtalt kalveserum, 2 mM glutamin, 10 mg / ml penicillin og 10 mg / ml streptomycin. </li></ol> Menneskelige fibroblaster GMO3349C og GMO8398A ble innhentet fra Coriell Institute for Medical Research (Camden, New Jersey), og ble brukt i denne studien. <ol start="2"><li> Kult...

<ol>
	<li>Jahoda, C. A., Whitehouse, J., Reynolds, A. J., Hole, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+follicle+dermal+cells+differentiate+into+adipogenic+and+osteogenic+lineages.">Hair follicle dermal cells differentiate into adipogenic and osteogenic lineages.</a> Exp. Dermatol. 12, 849 (2003).</li><li>Watt, F. M., Celso, L. o., C, V., Silva-Vargas, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+stem+cells:+an+update.">Epidermal stem cells: an update.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 16, 518 (2006).</li><li>Blanpain, C., Horsley, V., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+stem+cells:+turning+over+new+leaves.">Epithelial stem cells: turning over new leaves.</a> Cell. 128, 445 (2007).</li><li>Hunt, D. P., Jahoda, C., Chandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+skin-derived+precursors:+from+biology+to+clinical+translation.">Multipotent skin-derived precursors: from biology to clinical translation.</a> Vurr. Opin. Biotechnol. 20, 522 (2009).</li><li>Toma, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+multipotent+adult+stem+cells+from+the+dermis+of+mammalian+skin.">Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin.</a> Nat. Cell Biol. 3, 778 (2001).</li><li>Fernandes, K. J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dermal+niche+for+multipotent+adult+skin-derived+precursor+cells.">A dermal niche for multipotent adult skin-derived precursor cells.</a> Nat. Cell Biol. 6, 1082 (2004).</li><li>Wenzel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na&#239;ve+adult+stem+cells+from+patients+with+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+express+low+levels+of+progerin+in+vivo.">Na&#239;ve adult stem cells from patients with Hutchinson-Gilford progeria syndrome express low levels of progerin in vivo.</a> Bio. Open. 1, (2012).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25, 402 (2001).</li><li>Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. T., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skin-derived+precursors+(SKPs)+and+differentiation+and+enrichment+of+their+Schwann+cell+progeny.">Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny.</a> Nature Protocol. 1, 2803 (2006).</li><li>Toma, J. G., McKenzie, I., Bagli, D., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+multipotent+skin-derived+precursors+from+human+skin.">Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin.</a> Stem Cells. 23, 727 (2005).</li><li>Fernandes, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+neurogenic+potential+of+multipotent+skin-derived+precursors.">Analysis of the neurogenic potential of multipotent skin-derived precursors.</a> Electrophoresis. 201, 32 (2006).</li><li>Hill, l. K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+vascular+progenitor+cells+capable+of+endothelial+and+smooth+muscle+cell+function.">Human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells capable of endothelial and smooth muscle cell function.</a> Exp. Hematol. 38, 246 (2010).</li></ol>

Ved å anvende fremgangsmåten beskrevet heri, kan naive dermale stamceller bli isolert fra primære fibroblastkulturer dermale. Ved hjelp av denne tilnærmingen, vi nylig rapporterte isolering og karakterisering av voksne stamceller fra fibroblastkulturer stammer fra pasienter med en sjelden genetisk syndrom, Hutchinson-Gilford progeria syndrom 7. Som viser her de forløper celler uttrykker stamcelle markører er i stand til selvfornyelse og kan rettes til å differensiere i ulike cellulære linjene inkluder...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31966-047</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21885-108</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>Final conc.: 200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/ Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin solution (0.25%)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12 Nutrient Mixture (Ham)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21765-029</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>4114-TC-01M</td>
			<td>Final conc.: 40 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>Final conc.: 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFBB</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHG0043</td>
			<td>Final conc.: 5 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-b1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHG9204</td>
			<td>Final conc.: 2.5 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 flask</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>FALC353109</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS w/o CaMg</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-169</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8388.2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vector Inc.</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Minikit</td>
			<td>Qiagen, Valencia, CA</td>
			<td>74104</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omniscript Reverse Transcriptase</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205113</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast EvaGreen Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>172-5201</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15290-018</td>
			<td>Final conc.:1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 2. Specific reagents and equipment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

na&iuml;ve adult stem cells isolation from primary human fibroblast cultures

I løpet av det siste tiåret har flere voksne stamceller populasjoner blitt identifisert i menneskelig hud 1-4. Isolering av multipotent voksne dermal forløpere ble først rapportert av Miller F. D 5 laboratorium, 6. Disse tidlige studiene beskrev en multipotent forløper celle befolkningen fra voksen pattedyr dermis fem. Disse cellene - kalt sKPs, for hud-deriverte forløpere - ble isolert og utvidet fra gnagere og menneskelig hud og differensiert i både nevrale og mesodermal avkom, inkludert celletyper aldri funnet i huden, slik som nevroner fem. Immuncytokjemisk studier på kultiverte sKPs avdekket at cellene uttrykte vimentin og nestin, en mellomliggende filament protein uttrykt i nevrale og skjelettmuskulatur forløpere, i tillegg til fibronectin og multipotent stamcelle markører seks. Inntil nå har de voksne stamceller befolkningen sKPs vært isolert fra ferske innsamlede pattedyr hud biopsier. ve_content &quot;&gt; Nylig har vi etablert og rapporterte at en befolkning på hud avledet forløper celler kunne være tilstede i grunnskolen fibroblastkulturer etablert fra hud biopsier 7. Antakelsen om at noen somatiske stamceller kan ligge i grunnskolen fibroblastkulturer på tidlige befolkningen doublings var basert på følgende observasjoner: (1) sKPs og primære fibroblastkulturer er utledet fra dermis, og derfor et lite antall SKP celler kan være tilstede i dermale primære fibroblastkulturer og (2) primære fibroblastkulturer dyrket fra frosne alikvoter som har vært utsettes for ugunstig temperatur under lagring eller overføring inneholdt et lite antall celler som forble levedyktige 7.. disse sjeldne cellene var i stand til å utvide seg og kan passeres flere ganger. Denne observasjon antydet at et lite antall celler med høy spredning potens og resistens mot stress var til stede i menneskelige fibroblastkulturer 7. Vi benyttet av disse funnene for å etablere en protokoll for hurtig isolering av voksne stamceller fra primære fibroblastkulturer som er lett tilgjengelig fra vev bredden over hele verden (se figur 1). Denne metoden har viktig betydning som det lar isolering av forløper celler når huden prøver er ikke tilgjengelig mens fibroblastkulturer kan være tilgjengelig fra vev banker, og dermed åpner nye muligheter til å dissekere de molekylære mekanismene bak sjeldne genetiske sykdommer samt modellering sykdommer i en parabolen.

Vi viser at en populasjon av celler som selektivt utvider å generere SKP sfærer under kontrollerte vekst tilstand bestående av EGF og FGF2 er til stede i grunn-dermale fibroblastkulturer (figur 1) som vi nylig rapportert 7.. Fibroblastkulturer fra PPD-er 15 til 25 som vanligvis svarer til de primære fibroblaster stammer er tilgjengelige fra celle banker ble brukt i denne studien. Fibroblastkulturer innsendt til dobbel behandling bestående av kald temperatur b...

Watch this Scientific Journal Video about NaÃ¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures Video at JoVE.com

NaÃ¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures Video (Video) | JoVE

Vi rapporterer en metode for å isolere naive multipotent hud-derived forløper (SKP) celler fra primære humane fibroblastkulturer. Vi viser at disse sKPs avledet fra fibroblastkulturer dele lignende stamcelleegenskaper til de som stammer direkte fra menneskelig hud biopsier. Disse cellene uttrykke neural crest markør, nestin, i tillegg til de multipotent markører som OCT4 og Nanog.

Naive Adult Stem Cells Isolasjon fra primære humane fibroblastkulturer

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Research

JoVE Journal

Biology

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells Video (Video) | JoVE

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents Video (Video) | JoVE

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts Video (Video) | JoVE

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos Video (Video) | JoVE

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin Video (Video) | JoVE

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts Video (Video) | JoVE

Velge og isolere kolonier av menneskeskapte pluripotent stamceller omprogrammert fra voksne Fibroblaster

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells Video (Video) | JoVE

Utarbeidelse av mus embryonale fibroblast celler Egnet for dyrking humane embryonale og Induced pluripotent stamceller

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures Video (Video) | JoVE

Rapid Fibroblast fjerning fra High Density Menneskelig embryonale stamceller kulturer

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolation and Culture of Myofibers and their Satellite Cells | Protocol (Video) | JoVE

Isolasjon og kultur av individuelle myofibers og deres satellitt celler fra voksne Skeletal Muscle

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates Video (Video) | JoVE

Manuell Isolering av adipose-avledet stamceller fra menneske Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...