Name: na&iuml;ve adult stem cells isolation from primary human fibroblast cultures
Uploaded: 2013-05-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about NaÃ¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures Video at JoVE.com

Эта работа выполнена при поддержке Фонда Александра фон Гумбольдта (5090371), Кристин Кюне Центра исследований аллергии и образования (CK-CARE) и Баварской Staatsministerium (в КД).

1. SKP Изоляция от первичных культурах фибробластов <ol><li> Фибробластов культур или из банков клеток или получен непосредственно из биопсии кожи поддерживают в культуре фибробластов ростовой среде DMEM, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 10 мг / мл пенициллина и 1...

<ol>
	<li>Jahoda, C. A., Whitehouse, J., Reynolds, A. J., Hole, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+follicle+dermal+cells+differentiate+into+adipogenic+and+osteogenic+lineages.">Hair follicle dermal cells differentiate into adipogenic and osteogenic lineages.</a> Exp. Dermatol. 12, 849 (2003).</li><li>Watt, F. M., Celso, L. o., C, V., Silva-Vargas, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+stem+cells:+an+update.">Epidermal stem cells: an update.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 16, 518 (2006).</li><li>Blanpain, C., Horsley, V., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+stem+cells:+turning+over+new+leaves.">Epithelial stem cells: turning over new leaves.</a> Cell. 128, 445 (2007).</li><li>Hunt, D. P., Jahoda, C., Chandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+skin-derived+precursors:+from+biology+to+clinical+translation.">Multipotent skin-derived precursors: from biology to clinical translation.</a> Vurr. Opin. Biotechnol. 20, 522 (2009).</li><li>Toma, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+multipotent+adult+stem+cells+from+the+dermis+of+mammalian+skin.">Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin.</a> Nat. Cell Biol. 3, 778 (2001).</li><li>Fernandes, K. J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dermal+niche+for+multipotent+adult+skin-derived+precursor+cells.">A dermal niche for multipotent adult skin-derived precursor cells.</a> Nat. Cell Biol. 6, 1082 (2004).</li><li>Wenzel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na&#239;ve+adult+stem+cells+from+patients+with+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+express+low+levels+of+progerin+in+vivo.">Na&#239;ve adult stem cells from patients with Hutchinson-Gilford progeria syndrome express low levels of progerin in vivo.</a> Bio. Open. 1, (2012).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25, 402 (2001).</li><li>Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. T., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skin-derived+precursors+(SKPs)+and+differentiation+and+enrichment+of+their+Schwann+cell+progeny.">Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny.</a> Nature Protocol. 1, 2803 (2006).</li><li>Toma, J. G., McKenzie, I., Bagli, D., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+multipotent+skin-derived+precursors+from+human+skin.">Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin.</a> Stem Cells. 23, 727 (2005).</li><li>Fernandes, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+neurogenic+potential+of+multipotent+skin-derived+precursors.">Analysis of the neurogenic potential of multipotent skin-derived precursors.</a> Electrophoresis. 201, 32 (2006).</li><li>Hill, l. K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+vascular+progenitor+cells+capable+of+endothelial+and+smooth+muscle+cell+function.">Human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells capable of endothelial and smooth muscle cell function.</a> Exp. Hematol. 38, 246 (2010).</li></ol>

С помощью способа, описанного здесь, наивных кожные стволовые клетки могут быть выделены из первичных культур кожных фибробластов. Используя этот подход, мы недавно сообщали выделение и характеристика взрослых стволовых клеток из культуры фибробластов, взятых от пациентов с редким г?...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31966-047</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21885-108</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>Final conc.: 200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/ Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin solution (0.25%)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12 Nutrient Mixture (Ham)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21765-029</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>4114-TC-01M</td>
			<td>Final conc.: 40 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>Final conc.: 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFBB</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHG0043</td>
			<td>Final conc.: 5 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-b1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHG9204</td>
			<td>Final conc.: 2.5 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 flask</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>FALC353109</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS w/o CaMg</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-169</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8388.2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vector Inc.</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Minikit</td>
			<td>Qiagen, Valencia, CA</td>
			<td>74104</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omniscript Reverse Transcriptase</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205113</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast EvaGreen Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>172-5201</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15290-018</td>
			<td>Final conc.:1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 2. Specific reagents and equipment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

na&iuml;ve adult stem cells isolation from primary human fibroblast cultures

За последнее десятилетие в ряде популяций взрослые стволовые клетки были идентифицированы в коже человека 1-4. Выделение кожного мультипотентны взрослых прекурсоров был впервые сообщил Миллер F. D лаборатории 5, 6. Эти ранние исследования, описанные мультипотентны популяции клеток предшественников от взрослых млекопитающих дермы 5. Эти клетки - называют SKPs, для кожи полученных предшественников - были выделены и расширена от грызунов и человека кожи и дифференцировались в обоих нервных и мезодермального потомство, в том числе типов клеток не найден в коже, такие как нейроны 5. Иммуноцитохимическая исследованиях на культуре SKPs показали, что клетки экспрессируют нестин и виментин, промежуточный белок нити выражены в нервной и предшественников скелетных мышц, в дополнение к фибронектин и мультипотентных стволовых клеток маркеры 6. До сих пор взрослые стволовые клетки SKPs населения не были выделены из свежесобранных млекопитающих биопсии кожи. ve_content &quot;&gt; В последнее время мы создали и сообщил, что население шкуру, полученную клетки-предшественники могли остаться присутствует в первичных культурах фибробластов устанавливается с биопсии кожи 7. предположение, что несколько стволовых соматические клетки могут находиться в первичных культурах фибробластов на ранних удвоения населения был основанных на следующие замечания: (1) SKPs и первичных культурах фибробластов являются производными от дермы, и, следовательно, небольшое количество клеток SKP могли остаться присутствует в первичных культурах фибробластов кожных и (2) первичных культурах фибробластов, выращенных из замороженного аликвоты, которые были подвергается неблагоприятным температура во время хранения или передачи содержал небольшое количество клеток, которые остаются жизнеспособными 7. Эти редкие клетки смогли расширить и может быть пассировать несколько раз. Это наблюдение предположить, что небольшое число клеток с высокой активностью пролиферации и устойчивость к стрессу присутствовали в человеческих культурах фибробластов 7. Мы воспользовались этими выводами установить протокол для быстрого выделения взрослых стволовых клеток из первичных культурах фибробластов, которые легко доступны из ткани банков по всему миру (рис. 1). Этот метод имеет важное значение, поскольку она позволяет изолировать клетки-предшественники, когда образцы кожи не доступны в то время культур фибробластов могут быть получены от банков тканей, тем самым, открывая новые возможности для того чтобы рассечь молекулярные механизмы, лежащие в основе редких генетических заболеваний, а также заболеваний в моделировании блюдо.

Мы показали, что популяция клеток, которые селективно расширить для создания СКП сфере при контролируемых условиях роста, состоящие из EGF и FGF2 присутствуют в первичных культурах фибробластов кожные (рис. 1), как мы недавно сообщила 7. Фибробластов культур о?...

Watch this Scientific Journal Video about NaÃ¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures Video at JoVE.com

NaÃ¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures Video (Video) | JoVE

Мы сообщаем о способе выделения наивным мультипотентны, полученных из кожи предшественника (SKP) клеток из первичной культуры фибробластов человека. Покажем, что эти SKPs, полученных из культур фибробластов имеют сходные свойства стволовых клеток, чтобы те, выводится непосредственно из биопсии человеческой кожи. Эти клетки экспрессируют нервной маркер гребень, нестин, в дополнение к мультипотентных маркеры, такие как OCT4 и Nanog.

Наивные стволовых клеток взрослых Изоляция от первичных человеческих культурах фибробластов

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Research

JoVE Journal

Biology

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells Video (Video) | JoVE

Выделение и расширение добычи взрослых человеческих эндотелиальных клеток, образующих колонии Прародитель

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents Video (Video) | JoVE

Создание первичных культурах фибробластов взрослых от грызунов

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts Video (Video) | JoVE

Выделение стволовых клеток из прав ксенотрансплантаты рака поджелудочной железы

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos Video (Video) | JoVE

Первичных клеточных культур из Drosophila Гаструла Эмбрионы

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin Video (Video) | JoVE

Выделение и культуры взрослых Эпителиальные стволовые клетки из человеческой кожи

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts Video (Video) | JoVE

Выбор и изоляция Колонии человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из взрослых Перепрограммированный Фибробласты

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells Video (Video) | JoVE

Подготовка мышиных эмбриональных фибробластов подходит для культивирования эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клетках

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures Video (Video) | JoVE

Быстрое удаление фибробластов с высокой плотностью эмбриональных стволовых клеток культур

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolation and Culture of Myofibers and their Satellite Cells | Protocol (Video) | JoVE

Выделение и культура Индивидуальные мышечных волокон и их сателлитные клетки от взрослых скелетных мышц

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates Video (Video) | JoVE

Руководство Выделение полученные из жировой ткани стволовые клетки из человека Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...