Name: na&iuml;ve adult stem cells isolation from primary human fibroblast cultures
Uploaded: 2013-05-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about NaÃ¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures Video at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Alexander von Humboldt-stiftelsen (5090371), den Christine Kühne Centrum för allergiforskning och utbildning (CK-CARE), och Bayerischen Staatsministerium (KD).

Ett. SKP Isolering från Primär fibroblastkulturer <ol><li> Fibroblastkulturer antingen från cellbanker eller direkt erhållen från hudbiopsier hålls i kultur i fibroblast tillväxtmedium DMEM innehållande 15% fetalt kalvserum, 2 mM glutamin, 10 mg / ml penicillin och 10 mg / ml streptomycin. </li></ol> Humanfibroblaster GMO3349C och GMO8398A erhölls från Coriell Institutet för Medicinsk forskning (Camden, NJ) och användes i denna studie. <ol start="2"><li> Kulturer från populatio...

<ol>
	<li>Jahoda, C. A., Whitehouse, J., Reynolds, A. J., Hole, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+follicle+dermal+cells+differentiate+into+adipogenic+and+osteogenic+lineages.">Hair follicle dermal cells differentiate into adipogenic and osteogenic lineages.</a> Exp. Dermatol. 12, 849 (2003).</li><li>Watt, F. M., Celso, L. o., C, V., Silva-Vargas, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+stem+cells:+an+update.">Epidermal stem cells: an update.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 16, 518 (2006).</li><li>Blanpain, C., Horsley, V., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+stem+cells:+turning+over+new+leaves.">Epithelial stem cells: turning over new leaves.</a> Cell. 128, 445 (2007).</li><li>Hunt, D. P., Jahoda, C., Chandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+skin-derived+precursors:+from+biology+to+clinical+translation.">Multipotent skin-derived precursors: from biology to clinical translation.</a> Vurr. Opin. Biotechnol. 20, 522 (2009).</li><li>Toma, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+multipotent+adult+stem+cells+from+the+dermis+of+mammalian+skin.">Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin.</a> Nat. Cell Biol. 3, 778 (2001).</li><li>Fernandes, K. J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dermal+niche+for+multipotent+adult+skin-derived+precursor+cells.">A dermal niche for multipotent adult skin-derived precursor cells.</a> Nat. Cell Biol. 6, 1082 (2004).</li><li>Wenzel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na&#239;ve+adult+stem+cells+from+patients+with+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+express+low+levels+of+progerin+in+vivo.">Na&#239;ve adult stem cells from patients with Hutchinson-Gilford progeria syndrome express low levels of progerin in vivo.</a> Bio. Open. 1, (2012).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25, 402 (2001).</li><li>Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. T., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skin-derived+precursors+(SKPs)+and+differentiation+and+enrichment+of+their+Schwann+cell+progeny.">Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny.</a> Nature Protocol. 1, 2803 (2006).</li><li>Toma, J. G., McKenzie, I., Bagli, D., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+multipotent+skin-derived+precursors+from+human+skin.">Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin.</a> Stem Cells. 23, 727 (2005).</li><li>Fernandes, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+neurogenic+potential+of+multipotent+skin-derived+precursors.">Analysis of the neurogenic potential of multipotent skin-derived precursors.</a> Electrophoresis. 201, 32 (2006).</li><li>Hill, l. K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+vascular+progenitor+cells+capable+of+endothelial+and+smooth+muscle+cell+function.">Human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells capable of endothelial and smooth muscle cell function.</a> Exp. Hematol. 38, 246 (2010).</li></ol>

Med användning av metoden som beskrivs häri, kan naiva dermala stamceller isoleras från primära dermala fibroblastkulturer. Med hjälp av denna metod, rapporterade vi nyligen isolering och karaktärisering av adulta stamceller från fibroblastkulturer härledda från patienter med en sällsynt genetisk syndrom, Hutchinson-Gilford progeria syndrom 7. Som visar här de precursorceller uttryckliga stamceller markörer klarar av själv-förnyande och kan riktas för att differentiera till olika cellulära hä...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31966-047</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21885-108</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>Final conc.: 200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/ Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin solution (0.25%)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12 Nutrient Mixture (Ham)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21765-029</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>4114-TC-01M</td>
			<td>Final conc.: 40 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>Final conc.: 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFBB</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHG0043</td>
			<td>Final conc.: 5 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-b1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHG9204</td>
			<td>Final conc.: 2.5 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 flask</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>FALC353109</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS w/o CaMg</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-169</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8388.2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vector Inc.</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Minikit</td>
			<td>Qiagen, Valencia, CA</td>
			<td>74104</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omniscript Reverse Transcriptase</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205113</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast EvaGreen Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>172-5201</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15290-018</td>
			<td>Final conc.:1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 2. Specific reagents and equipment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

na&iuml;ve adult stem cells isolation from primary human fibroblast cultures

Under det senaste decenniet har flera vuxna stamceller har identifierats i human hud 1-4. Isoleringen av multipotenta vuxna dermal prekursorer rapporterades först av Miller F. D laboratoriet 5, 6. Dessa tidiga studier beskrivs en multipotent befolkning prekursorcell från vuxna däggdjur dermis 5. Dessa celler - kallade SKPs, för hud-härledda prekursorer - isolerades och expanderades från gnagare och mänsklig hud och differentieras till både neurala och mesodermal avkomma, inklusive celltyper aldrig hittats i huden, till exempel nervceller 5. Immunocytokemiska studier på odlade SKPs avslöjade att celler uttryckte vimentin och nestin, ett mellanliggande filament protein uttryckt i neurala och skelettmuskel prekursorer, förutom fibronektin och multipotenta stamceller markörer cellen 6. Hittills har de adulta stamceller befolkningen SKPs isolerats från nyuppsamlade däggdjur hudbiopsier. ve_content &quot;&gt; Nyligen har vi etablerat och rapporterade att en population av hud härledda prekursorceller kan finnas kvar i primära fibroblastkulturer etablerade från hudbiopsier 7. Antagandet att några somatiska stamceller kan bosätta sig i primära fibroblastkulturer vid tidiga populationsfördubblingar var bygger på följande iakttagelser: (1) SKPs och primära kulturer fibroblaster härstammar från dermis, och därmed ett litet antal SKP celler kan finnas kvar i primära dermala fibroblastkulturer och (2) primära fibroblastkulturer vuxit från frysta portioner som har varit utsätts för ogynnsamma temperatur under lagring eller överföring innehöll ett litet antal celler som förblev lönsamt 7. Dessa sällsynta celler kunde expandera och kunde passera flera gånger. Denna observation föreslog att ett litet antal celler med hög spridning potens och motståndskraft mot stress var närvarande i humana fibroblastkulturer 7. Vi drog fördel av dessa resultat att upprätta ett protokoll för snabb isolering av adulta stamceller från primära fibroblastkulturer som är lätt tillgängliga från vävnad banker runt om i världen (figur 1). Denna metod har viktig betydelse eftersom den möjliggör isolering av prekursorceller när hudprover är inte tillgängliga när fibroblastkulturer kan vara tillgängliga från vävnadsbanker, alltså, öppnar nya möjligheter för att dissekera de molekylära mekanismerna bakom sällsynta genetiska sjukdomar samt sjukdomar modellering i en skålen.

Vi visar att en population av celler som selektivt expandera generera SKP sfärer under kontrollerade tillväxt tillstånd bestående av EGF och FGF2 finns i primära dermala fibroblastkulturer (figur 1) som vi nyligen rapporterat 7. Fibroblastkulturer från PPD: 15-25 som typiskt motsvarar de primära fibroblaster stammar tillgängliga från cellbanker användes i denna studie. Fibroblastkulturer inkommit till dubbel behandling bestående av kall temperatur behan...

Watch this Scientific Journal Video about NaÃ¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures Video at JoVE.com

NaÃ¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures Video (Video) | JoVE

Vi rapporterar en metod för att isolera naiva multipotenta hud-derived prekursorer (SKP) celler från primära humana fibroblastkulturer. Vi visar att dessa SKPs härrör från fibroblastkulturer delar liknande egenskaper stamceller till de som härrör direkt från mänsklig hud biopsier. Dessa celler uttrycker neurallisten markör, nestin, förutom de multipotenta markörer såsom Oct4 och Nanog.

Naiv Vuxna stamceller Isolering från primära humana fibroblastkulturer

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Research

JoVE Journal

Biology

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells Video (Video) | JoVE

Isolering och storskalig expansion av vuxen människa Endothelial kolonibildande progenitorceller

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents Video (Video) | JoVE

Etablera primärkulturer Vuxen Fibroblast från gnagare

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts Video (Video) | JoVE

Isolering av stamceller från mänskliga xenografter Pankreascancer

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos Video (Video) | JoVE

Primära cellkulturer från Drosophila Gastrula Embryon

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin Video (Video) | JoVE

Isolering och odling av vuxna Epithelial stamceller från mänskliga Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts Video (Video) | JoVE

Välja och isolera Kolonier av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller omprogrammeras från vuxna fibroblaster

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells Video (Video) | JoVE

Beredning av mus Embryonala Fibroblastceller Lämplig för odling av humana embryonala och inducerade pluripotenta stamceller

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures Video (Video) | JoVE

Snabb Fibroblast Borttagning med hög densitet mänskliga embryonala stamcellskulturer

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolation and Culture of Myofibers and their Satellite Cells | Protocol (Video) | JoVE

Isolering och odling av individuella Myofibers och deras satellit celler från vuxna skelettmuskulatur

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates Video (Video) | JoVE

Manuell Isolering av Fett-härledda stamceller från mänskliga Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...