Name: isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells
Uploaded: 2013-03-28T12:00:00
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Nous remercions Haruya Ohno, Kosaku Shinoda, Louis Sharp, Emi Tomoda, et Lauren Ruiz de discussion, une aide technique et aide à la rédaction du manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH (DK087853), du Programme de recherche biomédicale et percée de Asubio Pharm Inc SKULA a été pris en charge par un ACTIONS bourses de doctorat de l&#39;Université de Copenhague et l&#39;UE projet FP7 Diabat (SANTÉ-F2 -2011 à 278373) à Lise Madsen et Karsten Kristiansen. Nous reconnaissons aussi le centre DERC subvention (NIH P30 DK063720).

1. Préparer milieu de digestion Faire 5 ml par 5 souris par du tissu (environ 1 ml / 1 g tissu adipeux). <ol><li> Peser des enzymes de digestion: - Collaginase D: 1,5 u / ml (1108874103, 1 g, Roche, 70334223) - Dispase II: 2,4 u / ml (04942078001, 0.980 mg / lyo, Roche, 11466200) </li><li> Ajouter 25 ml de PBS et bien mélanger pour dissoudre </li><li> Ajouter CaCl 2 juste avant la digestion du tissu à une concentration finale de 10 mM </li></ol><p class="jove_ti...

<ol>
	<li>Barness, L. A., Opitz, J. M., Gilbert-Barness, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity:+genetic,+molecular,+and+environmental+aspects.">Obesity: genetic, molecular, and environmental aspects.</a> American Journal of Medical Genetics. Part A. 143A, 3016-3034 (2007).</li><li>Rothwell, N. J., Stock, M. 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Endocrinology and Metabolism. 298, E1244-E1253 (2010).</li><li>Petrovic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+(PPARgamma)+activation+of+epididymally+derived+white+adipocyte+cultures+reveals+a+population+of+thermogenically+competent,+UCP1-containing+adipocytes+molecularly+distinct+from+classic+brown+adipocytes.">Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2009).</li><li>Rong, J. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+mitochondrial+biogenesis+is+suppressed+in+db/db+and+high-fat+diet-fed+mice+and+improved+by+rosiglitazone.">Adipose mitochondrial biogenesis is suppressed in db/db and high-fat diet-fed mice and improved by rosiglitazone.</a> Diabetes. 56, 1751-1760 (2007).</li><li>Wilson-Fritch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+remodeling+in+adipose+tissue+associated+with+obesity+and+treatment+with+rosiglitazone.">Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone.</a> The Journal of Clinical Investigation. 114, 1281-1289 (2004).</li><li>Sell, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+agonism+increases+the+capacity+for+sympathetically+mediated+thermogenesis+in+lean+and+ob/ob+mice.">Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonism increases the capacity for sympathetically mediated thermogenesis in lean and ob/ob mice.</a> Endocrinology. 145, 3925-3934 (2004).</li><li>Fukui, Y., Masui, S., Osada, S., Umesono, K., Motojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+thiazolidinedione,+NC-2100,+which+is+a+weak+PPAR-gamma+activator,+exhibits+potent+antidiabetic+effects+and+induces+uncoupling+protein+1+in+white+adipose+tissue+of+KKAy+obese+mice.">A new thiazolidinedione, NC-2100, which is a weak PPAR-gamma activator, exhibits potent antidiabetic effects and induces uncoupling protein 1 in white adipose tissue of KKAy obese mice.</a> Diabetes. 49, 759-767 (2000).</li><li>Vernochet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBPalpha+and+the+corepressors+CtBP1+and+CtBP2+regulate+repression+of+select+visceral+white+adipose+genes+during+induction+of+the+brown+phenotype+in+white+adipocytes+by+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+agonists.">C/EBPalpha and the corepressors CtBP1 and CtBP2 regulate repression of select visceral white adipose genes during induction of the brown phenotype in white adipocytes by peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 4714-4728 (2009).</li><li>Tai, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+nuclear+receptor+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+promotes+brown+adipocyte+differentiation.">Activation of the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor gamma promotes brown adipocyte differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271, 29909-29914 (1996).</li><li>Sugii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPARgamma+activation+in+adipocytes+is+sufficient+for+systemic+insulin+sensitization.">PPARgamma activation in adipocytes is sufficient for systemic insulin sensitization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 22504-22509 (2009).</li></ol>

Nous présentons ici un système cellulaire fiable pour étudier le développement des cellules beige / brite dans les adipocytes en culture primaire chez la souris. Par rapport à plusieurs lignées cellulaires immortalisées disponibles, ce système est susceptible d&#39;offrir une importance accrue au brunissement de la graisse blanche in vivo. Même si l&#39;étude de ces adipocytes primaires offre certains avantages, il existe aussi quelques limitations et les préoccupations q...

<html> L&#39;obésité est dramatiquement dans le monde augmente et est maintenant considéré comme l&#39;un des problèmes les plus graves pour la santé publique 1. Cette condition est liée à un déséquilibre par rapport à l&#39;apport énergétique de dépenses et les résultats de l&#39;excès d&#39;énergie stockée sous forme de lipides dans le tissu adipeux blanc (WAT). WAT élargie est associée à une augmentation de masse corporelle et de poids, tandis que le tissu adipeux brun est capable de dissiper l&#39;énergie en excès pour produire de la chaleur. Ainsi BAT peut fonctionner comme une protection contre le froid et l&#39;obésité 2,3. Ceci est réalisé par le découplage du transport des électrons dans les mitochondries par la protéine découplante 1 (UCP1). Cette protéine est considérée comme une caractéristique de thermogenèse sans frisson dans la MTD 3. Plusieurs études de ces dernières années ont révélé que les humains adultes ont fonctionnel 4-8 BAT et, par conséquent, la manipulation des MTD chez l&#39;homme peut être une intervention thérapeutique potentielle dans la lutte contre l&#39;obésité et ses maladies associées. jove_content «preuves&gt; actuelles indiquent que les deux types d&#39;adipocytes bruns existent chez les rongeurs;« classique »ou« pré-existant &quot;graisse brune se développe pendant la période prénatale et forme dédiée dépôts adipeux brun dans la région inter-scapulaire et d&#39;autres tissus périphériques D&#39;autre part. , un &quot;inductible&quot; sous forme de graisse brune (que l&#39;on appelle les cellules brite ou beige) se développe pendant la phase post-natale et semble intercalées dans les tissus adipeux blancs. Les deux types d&#39;adipocytes bruns sont également séparés par différentes origines développementales. Alors que la pré-existant adipocytes bruns proviennent de myoblastsic-Myf5 comme précurseurs, les inductibles brite / beige cellules intercalées dans WAT proviennent d&#39;une lignée non Myf5 9,10. Par ailleurs, les voies de régulation de ce type de cellule est susceptible d&#39;être différente de la brune Myf5 dérivé adipocytes 11. Le développement des cellules beiges (ie &quot;brunissement&quot; de la graisse blanche) peuvent être activés en réponse à l&#39;exposition au froid chronique et àβ3-adrénergiques agonistes ou agonistes PPARy chez les adultes 12-14. Les cellules beige / brite sont susceptibles d&#39;être une cible thérapeutique prometteuse pour la manipulation de la balance énergétique globale et peut potentiellement faire partie du traitement de l&#39;obésité; par conséquent, il est important de comprendre les mécanismes moléculaires précis et voies de signalisation par laquelle des signaux environnementaux contrôlent le développement de beige cellules. Pour comprendre le contrôle moléculaire du brunissement de la graisse blanche, des expériences in vitro sont mieux adaptés comme la différenciation des pré-adipocytes se déroule plutôt de manière asynchrone et il est difficile de détecter les cellules dans 15 situ. Bien que les études sur le développement des adipocytes ont jusqu&#39;ici été effectuées principalement sur des lignées cellulaires telles que les cellules 3T3-L1, 3T3-F442A ou Hib1, ces lignées cellulaires semblent manquer de la signature moléculaire des cellules beiges. D&#39;autre part, les adipocytes primaires isolées à partir de WAT sous-cutanée sont les plus susceptibles de récapituler les process de brunissement de la graisse blanche dans une cellule autonome de la mode. Ici, nous fournissons un protocole pour une isolation efficace de la fraction stroma-vasculaire du tissu adipeux et pour induire le brunissement de la graisse blanche en réponse à des agonistes PPARy. La rosiglitazone a été montré pour être un médiateur particulièrement efficace de brunissement dans ces cellules. Comme suggéré précédemment 16, ce système cellulaire peut être utilisé pour servir un système cellulaire fiable pour étudier le développement des cellules beige / brite.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Réactif </td></tr><tr><td> Collaginase D </td><td> Roche </td><td> 11088874103 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase II </td><td> Roche </td><td> 04942078001 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Milieu DMEM </td><td> Pêcheur </td><td> 10017-CV </td><td> Avec 2,5 g / l de glucose et L-glutamine sans pyruvate de sodium </td></tr><tr><td> Insuline </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> T3 (3,3 &#39;,5-triiodo-L-thyronine) </td><td> Sigma </td><td> T-2877 </td><td></td></tr><tr><td> Indomethacin </td><td> Sigma </td><td> I-7378 </td><td></td></tr><tr><td> Dexaméthasone </td><td> Sigma </td><td> D-1756 </td><td></td></tr><tr><td> IBMX </td><td> Sigma </td><td> Je-5879 </td><td></td></tr><tr><td> La rosiglitazone </td><td> Sigma </td><td> R-2408 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Équipement </td></tr><tr><td> Plats revêtus de collagène </td><td> BD </td><td> 354450 </td><td> Plaques de 10 cm </td></tr><tr><td> 70 um filtre </td><td> BD Falcon </td><td> 352350 </td><td> Cellule filtre, nylon 70 um 1/EA </td></tr></tbody></table>

isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells

Adipocytes bruns ont la possibilité de découpler la chaîne respiratoire dans les mitochondries et dissiper l&#39;énergie chimique sous forme de chaleur. Développement d&#39;UCP1-positifs adipocytes bruns dans les tissus adipeux blancs (que l&#39;on appelle les cellules beige ou brite) est fortement induite par une variété de facteurs environnementaux tels que l&#39;exposition au froid ou chronique par des agonistes PPARy, par conséquent, ce type de cellule a un potentiel en tant que cible thérapeutique pour traitement de l&#39;obésité. Bien que la plupart des lignes adipocytes immortalisés ne peut pas résumer le processus de «brunissement» de la graisse blanche dans la culture, les adipocytes primaires isolés de la fraction vasculaire du stroma dans le tissu sous-cutané adipeux blanc (WAT) fournir un système fiable cellulaire pour étudier le contrôle moléculaire du développement des cellules beige / brite . Nous décrivons ici un protocole pour une isolation efficace des pré-adipocytes primaires et pour induire la différenciation des cellules beige / brite en culture. L&#39;effet de brunissement peut être évaluée par l&#39;expression de la graisse brune sélective marqueteurs tels que UCP1.

Brunissement des adipocytes primaires sont accessibles par la mesure de l&#39;expression d&#39;ARNm de Ucp1 et d&#39;autres gènes de graisse brune spécifique ou sélectif par QRT-PCR. La figure 1 présente des données d&#39;expression de gènes dans inguinales WAT-adipocytes primaires dérivés. Les cellules ont été induites à se différencier en présence de deux doses différentes de la rosiglitazone à 50 nM et 500 nM, respectivement. Un sous-ensemble de cellules a été traité avec d...

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Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Préadipocytes primaires blanches isolées à partir de tissus adipeux blancs chez la souris peuvent être différenciées en cellules beige / brite. Présenté ici est un système modèle cellulaire fiable pour étudier la régulation moléculaire de &quot;brunissement&quot; de graisse blanche.

L&#39;isolement et la différenciation des cellules stromales vasculaires de cellules Beige / Brite

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Isolement et animale expansion sans sérum du cordon ombilical humain dérivé cellules stromales mésenchymateuses (CSM) et des cellules endothéliales progénitrices Colony Forming (CPEF)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Recherche

Biologie

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induction et analyse des épithéliale à mésenchymateuses transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

L&#39;isolement et la culture primaire de cellules endothéliales aortiques de souris

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Isolement de CD146<sup&gt; +</sup&gt; Cellules Resident pulmonaire mésenchymateuses stromales de Rat Poumons

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Isolement de murin coronaire vasculaires cellules de muscle lisse

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Néphrotoxine microinjection dans Zebrafish au Modèle lésion rénale aiguë

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Une interface utilisateur graphique pour le suivi assisté par logiciel de la concentration de protéines dans les protrusions cellulaires dynamiques

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolement, caractérisation et différenciation des cellules souches cardiaques du coeur de souris adulte

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

Isolement, prolifération et différenciation des cellules souches adipeuses dérivées du macaque rhésus

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolement de myocytes auriculaires et ventriculaires murins de haute qualité pour des mesures simultanées des transitoires Ca2+ et du courant calcique de type L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...