Name: isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells
Uploaded: 2013-03-28T12:00:00
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Wir danken Haruya Ohno, Kosaku Shinoda, Louis Sharp, Emi Tomoda und Lauren Ruiz für Diskussionen, technische Hilfe und redaktionelle Unterstützung auf dem Manuskript. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem NIH (DK087853), aus dem Programm für Breakthrough Biomedical Research und von Asubio Pharm Inc. SKULA wurde von einem Anteil PhD-Stipendien an der Universität von Kopenhagen und dem EU FP7 Projekt Diabat (HEALTH-F2 abgestützt -2.011-278.373) an Lise Madsen und Karsten Kristiansen. Wir erkennen auch die DERC Zentrum Zuschuss (NIH P30 DK063720).

Ein. Bereiten Verdauung Medium Make 5 ml pro 5 Mäuse pro Gewebe (ca. 1 ml / 1 g Fettgewebe). <ol><li> Wiegen in Verdauungsenzyme: - Collaginase D: 1,5 u / ml (1108874103, 1 g, Roche, 70.334.223) - Dispase II: 2,4 u / ml (04942078001, 0.980 mg / lyo, Roche, 11.466.200) </li><li> 25 ml PBS und gut mischen sich aufzulösen </li><li> Hinzufügen CaCl 2 unmittelbar vor dem Aufschluss des Gewebes bei einer Endkonzentration von 10 mM </li></ol> 2. D...

<ol>
	<li>Barness, L. A., Opitz, J. M., Gilbert-Barness, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity:+genetic,+molecular,+and+environmental+aspects.">Obesity: genetic, molecular, and environmental aspects.</a> American Journal of Medical Genetics. Part A. 143A, 3016-3034 (2007).</li><li>Rothwell, N. J., Stock, M. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+identification+of+bipotential+adipocyte+progenitors+recruited+by+beta3-adrenoceptor+activation+and+high-fat+feeding.">In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding.</a> Cell Metabolism. 15, 480-491 (2012).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdifferentiation+properties+of+adipocytes+in+the+adipose+organ.">Transdifferentiation properties of adipocytes in the adipose organ.</a> American Journal of Physiology. 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Endocrinology and Metabolism. 298, E1244-E1253 (2010).</li><li>Petrovic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+(PPARgamma)+activation+of+epididymally+derived+white+adipocyte+cultures+reveals+a+population+of+thermogenically+competent,+UCP1-containing+adipocytes+molecularly+distinct+from+classic+brown+adipocytes.">Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2009).</li><li>Rong, J. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+mitochondrial+biogenesis+is+suppressed+in+db/db+and+high-fat+diet-fed+mice+and+improved+by+rosiglitazone.">Adipose mitochondrial biogenesis is suppressed in db/db and high-fat diet-fed mice and improved by rosiglitazone.</a> Diabetes. 56, 1751-1760 (2007).</li><li>Wilson-Fritch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+remodeling+in+adipose+tissue+associated+with+obesity+and+treatment+with+rosiglitazone.">Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone.</a> The Journal of Clinical Investigation. 114, 1281-1289 (2004).</li><li>Sell, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+agonism+increases+the+capacity+for+sympathetically+mediated+thermogenesis+in+lean+and+ob/ob+mice.">Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonism increases the capacity for sympathetically mediated thermogenesis in lean and ob/ob mice.</a> Endocrinology. 145, 3925-3934 (2004).</li><li>Fukui, Y., Masui, S., Osada, S., Umesono, K., Motojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+thiazolidinedione,+NC-2100,+which+is+a+weak+PPAR-gamma+activator,+exhibits+potent+antidiabetic+effects+and+induces+uncoupling+protein+1+in+white+adipose+tissue+of+KKAy+obese+mice.">A new thiazolidinedione, NC-2100, which is a weak PPAR-gamma activator, exhibits potent antidiabetic effects and induces uncoupling protein 1 in white adipose tissue of KKAy obese mice.</a> Diabetes. 49, 759-767 (2000).</li><li>Vernochet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBPalpha+and+the+corepressors+CtBP1+and+CtBP2+regulate+repression+of+select+visceral+white+adipose+genes+during+induction+of+the+brown+phenotype+in+white+adipocytes+by+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+agonists.">C/EBPalpha and the corepressors CtBP1 and CtBP2 regulate repression of select visceral white adipose genes during induction of the brown phenotype in white adipocytes by peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 4714-4728 (2009).</li><li>Tai, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+nuclear+receptor+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+promotes+brown+adipocyte+differentiation.">Activation of the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor gamma promotes brown adipocyte differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271, 29909-29914 (1996).</li><li>Sugii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPARgamma+activation+in+adipocytes+is+sufficient+for+systemic+insulin+sensitization.">PPARgamma activation in adipocytes is sufficient for systemic insulin sensitization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 22504-22509 (2009).</li></ol>

Hier präsentieren wir Ihnen eine zuverlässige zelluläre System, um die Entwicklung von beige / brite Zellen in primären kultivierten Adipozyten in Mäusen untersucht werden. Wie zu mehreren verfügbaren immortalisierten Zelllinien verglichen werden, ist dieses System dürfte verbesserte Relevanz für die Bräunung der weißen Fett in vivo bieten. Obwohl die Studie dieser primären Adipozyten bietet einige Vorteile, es existieren auch einige Einschränkungen und Bedenken, die unb...

<html> Adipositas ist dramatisch zunehmenden weltweit und ist heute eines der schwerwiegendsten Bedenken für die öffentliche Gesundheit 1 betrachtet. Dieser Zustand ist mit einem Ungleichgewicht in der Energieaufnahme relativ zu Ausgaben und führt überschüssige Energie als Lipid in weißem Fettgewebe (WAT) gespeichert verwandt. Vergrößerten WAT ist mit einer erhöhten Körpermasse und Gewicht zugeordnet ist, während braunes Fettgewebe hat die Fähigkeit, überschüssige Energie abzuleiten, um Wärme zu erzeugen. Daher BAT kann als Schutz gegen Kälte und Übergewicht 2,3 funktionieren. Dies wird durch Auskuppeln der Elektronentransport in Mitochondrien durch entkoppelnde Protein 1 (UCP1) erreicht. Dieses Protein wird als ein Markenzeichen für nonshivering Thermogenese in BAT 3. Mehrere Studien in den letzten Jahren gezeigt, dass erwachsene Menschen funktionale BAT 4-8 haben und somit Manipulation von BAT beim Menschen kann eine mögliche therapeutische Intervention im Kampf gegen Fettleibigkeit und die damit verbundenen Krankheiten. jove_content &quot;&gt; Aktuelle Daten zeigen, dass zwei Arten von braunen Fettzellen bei Nagetieren existieren;&quot; klassischen &quot;oder&quot; pre-existierenden &quot;braunes Fett entwickelt sich während der pränatalen Phase und bildet gewidmet braunen Fettgewebe Depots in interskapularen Region und anderen peripheren Geweben Auf der anderen Seite. ein &quot;induzierbare&quot; Form von braunem Fett (sogenannte brite oder beige Zellen) entwickelt sich während der postnatalen Stufe und erscheint durchsetzt im weißen Fettgewebe. Die zwei Typen von braunen Fettzellen auch von verschiedenen Entwicklungsstadien Ursprünge getrennt. Während die vorbestehenden braunen Fettzellen entstehen aus myoblastsic-ähnliche Myf5 Vorstufen entstehen die induzierbare brite / beige Zellen in WAT durchsetzt von einem nicht-Abstammungslinie Myf5 9,10. Zusätzlich Regulationswege dieses Zelltyps wahrscheinlich unterschiedlich vom Myf5 abgeleiteten braun ist Adipozyten 11. Die Entwicklung der beige Zellen (dh &quot;Bräunungs&quot; von weißem Fett) in Reaktion auf chronische Kälteexposition und aktiviert werdenβ3-Adrenozeptor-Agonisten oder PPAR &amp;ggr;-Agonisten bei Erwachsenen 12-14. Die beige / brite Zellen wahrscheinlich ein vielversprechendes therapeutisches Ziel für Manipulation Gesamtenergiebilanz sein und kann potentiell Teil Entfettungskur geworden, daher ist es wichtig, genaue molekulare Mechanismen und Signalwege durch welche Umweltreize steuern die Entwicklung der beige verstehen Zellen. Um die molekulare Kontrolle der Bräunung von weißem Fett zu verstehen, werden in vitro-Versuche am besten als Differenzierung von Präadipozyten erfolgt vielmehr asynchron geeignet und es ist schwierig, die Zellen in situ 15 detektieren. Obwohl Studien zur Entwicklung Adipozyten somit haben bis jetzt überwiegend auf Zelllinien wie 3T3-L1, 3T3-F442A oder HIB1 durchgeführt erscheinen diese Zelllinien, die molekulare Unterschrift beige Zellen fehlt. Auf der anderen Seite, sind primäre Adipozyten aus subkutaner WAT isoliert am ehesten die Verarbeitung rekapitulierens der Bräunung der weiße Fett in einer Zelle autonom. Hier bieten wir ein Protokoll für eine effektive Isolierung des Stroma-Kreislauf-Fraktion aus Fettgewebe und zur Induktion der Bräunung von weißem Fett in Reaktion auf PPAR &amp;ggr;-Agonisten. Rosiglitazon ist gezeigt worden, eine besonders effektive Mediator Bräunungsgrad in diesen Zellen vorhanden sein. Wie zuvor 16 angedeutet, kann dieses zellulare System verwendet, um eine zuverlässige Zellularsystem um die Entwicklung von beige / brite Zellen zu untersuchen dienen.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Collaginase D </td><td> Roche </td><td> 11088874103 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase II </td><td> Roche </td><td> 04942078001 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM-Medium </td><td> Fischer </td><td> 10017-CV </td><td> Mit 2,5 g / l Glukose und L-Glutamin, ohne Natriumpyruvat </td></tr><tr><td> Insulin </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> T3 (3,3 &#39;,5-Triiod-L-Thyronin) </td><td> Sigma </td><td> T-2877 </td><td></td></tr><tr><td> Indomethacin </td><td> Sigma </td><td> I-7378 </td><td></td></tr><tr><td> Dexamethasone </td><td> Sigma </td><td> D-1756 </td><td></td></tr><tr><td> IBMX </td><td> Sigma </td><td> I-5879 </td><td></td></tr><tr><td> Rosiglitazone </td><td> Sigma </td><td> R-2408 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ausrüstung </td></tr><tr><td> Kollagen beschichteten Schalen </td><td> BD </td><td> 354450 </td><td> 10 cm Platten </td></tr><tr><td> 70 um-Filter </td><td> BD Falcon </td><td> 352350 </td><td> Zellsieb, 70 um Nylon 1/ea </td></tr></tbody></table>

isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells

Braunen Fettzellen haben die Fähigkeit, die Atmungskette der Mitochondrien entkoppeln und dissipieren chemische Energie als Wärme. Entwicklung UCP1-positiven braunen Fettzellen in weißem Fettgewebe (sogenannte beige oder brite Zellen) hoch ist durch eine Vielzahl von Umweltreize wie chronische Kälteexposition oder durch PPAR &amp;ggr; Agonisten induziert wird, somit hat dieses Zelltyps Potential als therapeutisches Ziel für Behandlung von Fettleibigkeit. Obwohl die meisten verewigt Adipozyten Linien nicht rekapitulieren können den Prozess der &quot;Bräunung&quot; der weißen Fett in Kultur, primären Adipozyten aus stromalen vaskulären Fraktion im subkutanen weißen Fettgewebe (WAT) isoliert eine zuverlässige zelluläre System, um die molekulare Kontrolle der beige / brite-Zell-Entwicklung zu studieren . Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine effektive Trennung von Primär-und Präadipozyten zur Induzierung der Differenzierung zu beige / brite Zellen in Kultur. Die Bräunung Effekt kann durch die Expression von braunem Fett-selektive Markierung beurteilt werdenten wie UCP1.

Browning von primären Adipozyten kann durch Messung mRNA-Expression von UCP1 und andere braune Fett-spezifisch oder selektiv Gene durch qRT-PCR zugegriffen werden. Präsentiert in Abbildung 1 ist Genexpressionsdaten in inguinal WAT-abgeleiteten primären Adipozyten. Die Zellen wurden induziert in der Gegenwart von zwei verschiedenen Dosen von Rosiglitazon bei 50 nM und 500 nM unterscheiden sind. Eine Untergruppe von Zellen wurde mit Forskolin bei 10 pM für 4 Stunden vor der Ernte behandelt. D...

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Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Primäre weißen Präadipozyten aus weißem Fettgewebe von Mäusen isoliert werden in beige / brite Zellen unterschieden werden. Präsentiert hier ist ein zuverlässiger zellulären Modellsystem, um die molekulare Regulation von &quot;Bräunung&quot; der weiße Fett zu studieren.

Isolation und Differenzierung von Stroma-Vascular Cells Beige / Brite Cells

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Isolation und tierisches Serum Freie Expansion der menschlichen Nabelschnur Derived mesenchymale Stromazellen (MSCs) und Endothelial Colony Forming Progenitorzellen (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Forschung

Biologie

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Isolierung von CD146<sup&gt; +</sup&gt; Resident Lung mesenchymalen Stromazellen aus Rattenlungen

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Die Isolierung von murinen Coronary glatten Gefäßmuskelzellen

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Eine grafische Benutzeroberfläche für die softwaregestützte Verfolgung der Proteinkonzentration in dynamischen zellulären Vorsprüngen

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolierung, Charakterisierung und Differenzierung von kardialen Stammzellen von Erwachsenen Maus Herzen

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

Isolierung, Proliferation und Differenzierung von Rhesusaffen-Fettstammzellen

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolierung von hochwertigen atrialen und ventrikulären Myozyten der Maus für die simultane Messung von Ca2+ Transienten und L-Typ Calciumstrom

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...