Name: isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells
Uploaded: 2013-03-28T12:00:00
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Ringraziamo Haruya Ohno, Kosaku Shinoda, Louis Sharp, Emi Tomoda, e Lauren Ruiz per la discussione, assistenza tecnica e assistenza editoriale sul manoscritto. Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti del NIH (DK087853), dal Programma per la Ricerca Biomedica e dal Breakthrough Asubio Pharm Inc. per SKULA stato sostenuto da una SHARE borse di dottorato di ricerca presso l&#39;Università di Copenhagen e l&#39;Unione europea del 7 ° PQ progetto Diabat (HEALTH-F2 -2.011-278373) di Lise Madsen e Karsten Kristiansen. Riconosciamo inoltre il centro DERC sovvenzione (NIH DK063720 P30).

1. Preparare Medio Digestione Fare 5 ml per 5 topi per tessuti (circa 1 ml / 1 tessuto adiposo g). <ol><li> Pesare in enzimi digestivi: - Collaginase D: 1,5 u / ml (1108874103, 1 g, Roche, 70334223) - Dispasi II: 2.4 U / ml (04942078001, 0980 mg / lyo, Roche, 11466200) </li><li> Aggiungere 25 ml di PBS e mescolare bene per sciogliere </li><li> Aggiungere CaCl 2 appena prima digestione del tessuto ad una concentrazione finale di 10 mM </li></ol><p class="jove_title"...

<ol>
	<li>Barness, L. A., Opitz, J. M., Gilbert-Barness, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity:+genetic,+molecular,+and+environmental+aspects.">Obesity: genetic, molecular, and environmental aspects.</a> American Journal of Medical Genetics. Part A. 143A, 3016-3034 (2007).</li><li>Rothwell, N. J., Stock, M. 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Qui vi presentiamo un sistema affidabile cellulare per studiare lo sviluppo di cellule beige / brite in colture primarie adipociti nei topi. Rispetto a diverse linee cellulari immortalizzate disponibili, questo sistema è suscettibile di offrire maggiore rilevanza alla doratura di grasso bianco in vivo. Anche se lo studio di questi adipociti primari offre alcuni vantaggi, esistono anche alcune limitazioni e preoccupazioni che sono importanti da considerare. Primo, questo sistema è ...

<html> L&#39;obesità è in aumento in tutto il mondo in modo drammatico ed è ora considerato una delle preoccupazioni più gravi per la salute pubblica 1. Questa condizione si riferisce ad un squilibrio in relazione al consumo di energia spesa e risultati in eccesso di energia memorizzata come lipidi nel tessuto adiposo bianco (WAT). WAT allargata è associata con un aumento di massa corporea e il peso, mentre il tessuto adiposo bruno ha la capacità di dissipare l&#39;energia in eccesso per produrre calore. Quindi BAT può funzionare sia come protezione contro freddo e l&#39;obesità 2,3. Questo si ottiene disaccoppiamento del trasporto di elettroni nei mitocondri di disaccoppiamento della proteina 1 (UCP1). Questa proteina è considerato un marchio di garanzia per nonshivering termogenesi nel BAT 3. Diversi studi negli ultimi anni hanno rivelato che gli esseri umani adulti hanno 4-8 BAT funzionale e, di conseguenza, la manipolazione delle BAT negli esseri umani può essere un possibile intervento terapeutico nella lotta contro l&#39;obesità e le malattie correlate. jove_content &quot;prove&gt; corrente indica che due tipi di adipociti bruni esistono in roditori,&quot; classico &quot;o&quot; pre-esistente &quot;grasso bruno si sviluppa durante la fase prenatale e forma dedicati depositi adiposi marroni in regione interscapolare e di altri tessuti periferici D&#39;altra parte. , una forma &quot;inducibile&quot; di grasso bruno (così chiamate cellule brite o beige) si sviluppa durante la fase post-natale e appare intervallati nel tessuto adiposo bianco. I due tipi di adipociti bruni sono separati da diverse origini dello sviluppo. Mentre il pre-esistente adipociti bruni derivano da myoblastsic-come Myf5 precursori, i brite / beige cellule inducibili intervallati in WAT nascono da una non-Myf5 lignaggio 9,10. Inoltre, percorsi di regolamentazione di questo tipo di cellule è probabile che sia diverso da quello Myf5 derivato marrone adipociti 11. Lo sviluppo delle cellule beige (cioè &quot;doratura&quot; di grasso bianco) può essere attivato in risposta a esposizione cronica a freddo eβ3-adrenergici agonisti o agonisti PPARy negli adulti 12-14. Le cellule beige / brite sono suscettibili di essere un bersaglio terapeutico promettente per la manipolazione di bilancio energetico complessivo e può potenzialmente diventare parte del trattamento dell&#39;obesità, di conseguenza, è importante capire precisi meccanismi molecolari e vie di segnalazione da stimoli ambientali che controllano lo sviluppo del beige cellule. Per comprendere il controllo molecolare della doratura di grasso bianco, esperimenti in vitro sono più adatti come differenziazione dei preadipociti avviene piuttosto asincrono ed è difficile rilevare le cellule in situ 15. Sebbene studi sullo sviluppo adipociti sono state finora eseguite principalmente su linee cellulari quali 3T3-L1, 3T3-F442A o HIB1, queste linee cellulari sembrano non firma molecolare delle cellule beige. D&#39;altra parte, adipociti primari isolati da sottocutaneo WAT hanno più probabilità di ricapitolare i process di doratura di grasso bianco in modo cellula autonoma. Qui forniamo un protocollo per un efficace isolamento della frazione stromale-vascolare da tessuti adiposi e per indurre l&#39;imbrunimento del grasso bianco in risposta ad agonisti PPARy. Rosiglitazone ha dimostrato di essere un mediatore particolarmente efficace di doratura in queste cellule. Come suggerito in precedenza 16, questo sistema cellulare può essere utilizzato per servire un sistema cellulare affidabile per studiare lo sviluppo delle cellule beige / brite.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Collaginase D </td><td> Roche </td><td> 11088874103 </td><td></td></tr><tr><td> Dispasi II </td><td> Roche </td><td> 04942078001 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM media </td><td> Pescatore </td><td> 10017-CV </td><td> Con 2,5 g / l di glucosio e L-glutammina senza piruvato di sodio </td></tr><tr><td> Insulina </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> T3 (3,3 &#39;,5-triiodo-L-tironina) </td><td> Sigma </td><td> T-2877 </td><td></td></tr><tr><td> Indometacina </td><td> Sigma </td><td> I-7378 </td><td></td></tr><tr><td> Desametasone </td><td> Sigma </td><td> D-1756 </td><td></td></tr><tr><td> IBMX </td><td> Sigma </td><td> I-5879 </td><td></td></tr><tr><td> Rosiglitazone </td><td> Sigma </td><td> R-2408 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Piatti collagene rivestite </td><td> BD </td><td> 354450 </td><td> 10 centimetri piastre </td></tr><tr><td> 70 pm filtro </td><td> BD Falcon </td><td> 352350 </td><td> Cella filtro, 70 micron nylon 1/ea </td></tr></tbody></table>

isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells

Adipociti bruni hanno la capacità di disaccoppiare la catena respiratoria nei mitocondri e dissipare l&#39;energia chimica sotto forma di calore. Sviluppo di adipociti bruni UCP1-positive nei tessuti adiposi bianchi (cosiddetta cellule beige o brite) è altamente indotta da una varietà di stimoli ambientali come esposizione cronica freddo o da agonisti PPARy, quindi, questo tipo di cella ha un potenziale come un obiettivo terapeutico trattamento dell&#39;obesità. Sebbene la maggior parte delle linee degli adipociti immortalizzate non può ricapitolare il processo di &quot;doratura&quot; di grasso bianco nella cultura, adipociti primari isolati da stromale frazione vascolare nel tessuto sottocutaneo adiposo bianco (WAT) forniscono un sistema affidabile cellulare per studiare il controllo molecolare di beige / brite lo sviluppo delle cellule . Qui si descrive un protocollo per l&#39;isolamento efficace preadipociti primarie e per indurre la differenziazione di cellule beige / brite in coltura. L&#39;effetto di doratura può essere valutata mediante l&#39;espressione di grasso bruno-selettivo marchioERS come UCP1.

Browning di adipociti primari può accedere misurando l&#39;espressione di mRNA di Ucp1 e altri geni grasso bruno-specifici o selettivi per RT-PCR. Presentato in figura 1 è dati di espressione genica in inguinali WAT-derivati ​​adipociti primari. Le cellule sono state indotte a differenziarsi in presenza di due diverse dosi di rosiglitazone a 50 nm e 500 nm, rispettivamente. Un sottoinsieme di cellule è stato trattato con forskolin a 10 pM per 4 ore prima della raccolta. Ciò provocherà-...

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Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Primarie preadipociti bianchi isolati dal tessuto adiposo bianco nei topi possono essere differenziate in cellule del beige / brite. Presentato qui è un sistema affidabile modello cellulare per studiare la regolazione molecolare della &quot;doratura&quot; di grasso bianco.

Isolamento e la differenziazione di cellule stromali vascolari alle celle Beige / Brite

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Isolamento e di espansione degli animali siero gratuito di cordone ombelicale umano derivato cellule stromali mesenchimali (MSC) e cellule endoteliali progenitrici formanti colonia (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Ricerca

Biologia

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induzione e Analisi dei epiteliale a Mesenchymal Transizione

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolamento e colture primarie di cellule di topo aortica endoteliali

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Isolamento di CD146<sup&gt; +</sup&gt; cellule residenti del polmone mesenchimali stromali da Rat Polmoni

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

L&#39;isolamento di Murine coronarica vascolari cellule muscolari lisce

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Un&#39;interfaccia utente grafica per il monitoraggio assistito della concentrazione di proteine ​​in protrusioni cellulari dinamiche

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolamento, caratterizzazione e differenziamento di cellule staminali cardiache dal cuore di topo adulto

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

Isolamento, proliferazione e differenziamento di cellule staminali derivate dall'adiposio del macaco rhesus

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolamento di miociti atriali e ventricolari murini di alta qualità per misurazioni simultanee di transitori Ca2+ e corrente di calcio di tipo L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...