Name: isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells
Uploaded: 2013-03-28T12:00:00
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Agradecemos Haruya Ohno, Kosaku Shinoda, Louis Sharp, Emi Tomoda, e Lauren Ruiz para discussão, ajuda técnica e assistência editorial no manuscrito. Este trabalho foi suportado por concessões do NIH (DK087853), do Programa de Pesquisa Biomédica e de ruptura de Asubio Pharm Inc. para SKULA foi apoiado por uma AÇÃO bolsas de doutoramento da Universidade de Copenhague e da UE FP7 projeto Diabat (SAÚDE-F2 -2.011-278373) Lise de Madsen e Kristiansen Karsten. Reconhecemos também o DERC centro de subvenção (NIH P30 DK063720).

1. Prepare Médio Digestão Fazer 5 ml por 5 ratinhos por tecido (aproximadamente 1 ml / 1 g de tecido adiposo). <ol><li> Pesar em enzimas da digestão: - D Collaginase: 1,5 u / ml (1108874103, 1 g, Roche, 70334223) - Dispase II: 2,4 u / ml (04942078001, 0980 mg / lyo, Roche, 11466200) </li><li> Adicionar 25 ml de PBS e misturar bem para dissolver </li><li> Adicionar CaCl 2 imediatamente antes da digestão do tecido com uma concentração final de 10 mM </li></ol><...

<ol>
	<li>Barness, L. A., Opitz, J. M., Gilbert-Barness, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity:+genetic,+molecular,+and+environmental+aspects.">Obesity: genetic, molecular, and environmental aspects.</a> American Journal of Medical Genetics. Part A. 143A, 3016-3034 (2007).</li><li>Rothwell, N. J., Stock, M. 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Endocrinology and Metabolism. 298, E1244-E1253 (2010).</li><li>Petrovic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+(PPARgamma)+activation+of+epididymally+derived+white+adipocyte+cultures+reveals+a+population+of+thermogenically+competent,+UCP1-containing+adipocytes+molecularly+distinct+from+classic+brown+adipocytes.">Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2009).</li><li>Rong, J. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+nuclear+receptor+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+promotes+brown+adipocyte+differentiation.">Activation of the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor gamma promotes brown adipocyte differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271, 29909-29914 (1996).</li><li>Sugii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPARgamma+activation+in+adipocytes+is+sufficient+for+systemic+insulin+sensitization.">PPARgamma activation in adipocytes is sufficient for systemic insulin sensitization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 22504-22509 (2009).</li></ol>

Aqui apresentamos um sistema confiável celular para estudar o desenvolvimento de células bege / brite em adipócitos primários cultivados em camundongos. Em comparação com várias linhas de células imortalizadas disponíveis, este sistema é susceptível de oferecer relevância melhorada para o escurecimento do branco gordura in vivo. Mesmo que o estudo desses adipócitos primários oferece algumas vantagens, também existem algumas limitações e preocupações que são impor...

<html> A obesidade é dramaticamente mundial de aumento e agora é considerado uma das preocupações mais graves para a saúde pública 1. Esta condição está relacionada a um desequilíbrio em relação a ingestão de energia a despesa e resulta em excesso de energia armazenada como lípidos em tecido adiposo branco (WAT). WAT alargada está associada com aumento da massa corporal e do peso, enquanto que o tecido adiposo castanho tem a capacidade de dissipar o excesso de energia para produção de calor. Daí BAT pode funcionar como proteção contra o frio e obesidade 2,3. Isto é conseguido através do desacoplamento de transporte de electrões das mitocôndrias pela proteína desacopladora 1 (UCP1). Esta proteína é considerado um marco para a termogênese sem BAT em ​​3. Vários estudos nos últimos anos revelou que os seres humanos adultos têm funcional BAT 4-8 e, consequentemente, a manipulação da BAT em ​​seres humanos pode ser uma intervenção potencial terapêutico na batalha contra a obesidade e suas doenças relacionadas. jove_content &quot;&gt; evidência corrente indica que os dois tipos de adipócitos marrons existir em roedores;&quot; clássica &quot;ou&quot; pré-existente &quot;gordura marrom se desenvolve durante a fase pré-natal e forma depósitos de gordura marrom dedicados na região interescapular e outros tecidos periféricos Por outro lado. , um &quot;induzível&quot; forma de gordura marrom (assim chamadas células brite ou bege) desenvolve durante a fase pós-natal e aparece intercalada nos tecidos adiposos brancos. Os dois tipos de adipócitos marrons também são separadas por diferentes origens desenvolvimentistas. Enquanto a pré-existente adipócitos marrons surgem myoblastsic-like Myf5 precursores, os indutíveis brite / bege células intercaladas em WAT surgir a partir de uma linhagem não Myf5 9,10. Além disso, as vias de regulação deste tipo de células é susceptível de ser diferente do marrom Myf5 derivado 11. adipócitos O desenvolvimento das células (isto é, bege &quot;escurecimento&quot; branco de gordura) pode ser activado em resposta à exposição ao frio e à crónicaβ3-adrenérgicos agonistas ou agonistas PPARy em adultos 12-14. As células bege / brite são susceptíveis de constituir um alvo terapêutico promissor para a manipulação do equilíbrio energético geral e pode potencialmente tornar-se parte do tratamento da obesidade, portanto, é importante compreender os mecanismos moleculares precisos e caminhos de sinalização através dos quais estímulos ambientais controlam o desenvolvimento de cor bege células. Para compreender o controlo molecular do escurecimento de gordura branca, em experiências in vitro são os mais adequados como diferenciação de pré-adipócitos em vez ocorre de forma assíncrona, e é difícil de detectar as células em 15 situ. Embora os estudos sobre o desenvolvimento dos adipócitos têm até agora sido realizada principalmente em linhas de células, tais como células 3T3-L1, 3T3-F442A ou HIB1, estas linhas celulares parecem não ter a assinatura molecular de células de bege. Por outro lado, os adipócitos primários isolados de WAT subcutânea são mais susceptíveis de recapitular o process do escurecimento da gordura branca em uma forma de célula autônoma. Aqui nós fornecemos um protocolo para o isolamento eficaz da fracção do estroma vascular a partir de tecido adiposo e para induzir o escurecimento da gordura branca em resposta a agonistas de PPARy. Rosiglitazona foi demonstrado ser um mediador especialmente eficaz de escurecimento nessas células. Tal como anteriormente sugerido 16, este sistema celular pode ser utilizada para servir um sistema fiável celular para estudar o desenvolvimento de células bege / brite.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagente </td></tr><tr><td> D Collaginase </td><td> Roche </td><td> 11088874103 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase II </td><td> Roche </td><td> 04942078001 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Meio DMEM </td><td> Pescador </td><td> 10.017-CV </td><td> Com 2,5 g de glucose / l de L-glutamina e sem piruvato de sódio </td></tr><tr><td> Insulina </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> T3 (3,3 &#39;,5-triiodo-L-tironina) </td><td> Sigma </td><td> T-2877 </td><td></td></tr><tr><td> Indometacina </td><td> Sigma </td><td> I-7378 </td><td></td></tr><tr><td> Dexametasona </td><td> Sigma </td><td> D-1756 </td><td></td></tr><tr><td> IBMX </td><td> Sigma </td><td> I-5879 </td><td></td></tr><tr><td> Rosiglitazona </td><td> Sigma </td><td> R-2408 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Pratos de colágeno revestidas </td><td> BD </td><td> 354450 </td><td> Placas de 10 cm </td></tr><tr><td> 70 um filtro </td><td> BD Falcon </td><td> 352350 </td><td> Célula coador, 70 um nylon 1/ea </td></tr></tbody></table>

isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells

Adipócitos marrons tem a capacidade de dissociar a cadeia respiratória nas mitocôndrias e dissipar a energia química na forma de calor. Desenvolvimento da UCP1-positivos adipócitos marrons em tecidos adiposos brancos (as chamadas células bege ou brite) é altamente induzida por uma variedade de estímulos ambientais, tais como a exposição ao frio ou crónica por agonistas PPARy, portanto, esse tipo de célula tem potencial como um alvo terapêutico para tratamento da obesidade. Embora a maioria das linhas de adipócitos imortalizados não pode recapitular o processo de &quot;escurecimento&quot; da gordura branca na cultura, os adipócitos primários isolados da fração vascular estromal no tecido adiposo subcutâneo branco (WAT) fornecer um sistema confiável celular para estudar o controle molecular de bege / brite desenvolvimento de células . Aqui descrevemos um protocolo para isolamento eficaz de pré-adipócitos primários e para a indução de diferenciação de células bege / brite em cultura. O efeito de escurecimento pode ser avaliada através da expressão de marca selectiva gordura marromers como UCP1.

Browning dos adipócitos primários pode ser acessado através da medição expressão de mRNA de UCP1 e outros genes marrons de gordura específica ou selectiva por qRT-PCR. Apresentado na Figura 1 são dados de expressão genética em inguinais WAT-adipócitos primários derivados. As células foram induzidas a diferenciar-se em presença de duas doses diferentes de rosiglitazona a 50 nM e 500 nM, respectivamente. Um subconjunto de células foi tratado com forscolina a 10 uM, durante 4 horas ...

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Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Principais pré-adipócitos brancos isolados de tecidos adiposos brancos em ratos podem ser diferenciadas em células bege / brite. Apresentado aqui é um sistema modelo celular fiável para estudar a regulação molecular de &quot;escurecimento&quot; da gordura branca.

Isolamento e diferenciação de células estromais vasculares para Células Bege / Brite

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Isolamento e animais de Expansão de soro livre de cordão umbilical humano Derivado células mesenquimais estromais (MSCs) e endoteliais Células Progenitoras Colony Forming (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Biologia

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolamento e cultura primária de células de camundongo aórtica endoteliais

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Isolamento de CD146<sup&gt; +</sup&gt; Células Residente Lung estromais mesenquimais de rato Pulmões

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Isolamento de Murino vasculares coronários células musculares lisas

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxina microinjeção no peixe-zebra ao modelo de lesão renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Uma interface de usuário gráfica para rastreamento assistido por software da concentração de proteínas em protrusões celulares dinâmicas

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco cardíacas do coração de rato adulto

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

Isolamento, Proliferação e Diferenciação de Células-Tronco Derivadas de Adiposos de Macacos Rhesus

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolamento de miócitos murinos atrial e ventricular de alta qualidade para medidas simultâneas de Ca2+ transitórios e corrente de cálcio tipo L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...