Name: isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells
Uploaded: 2013-03-28T12:00:00
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Damos las gracias a Haruya Ohno, Shinoda Kosaku, Sharp Louis, Tomoda Emi, y Lauren Ruiz de discusión, ayuda técnica y asistencia editorial sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por becas de los NIH (DK087853), del Programa de Investigación Biomédica y de Breakthrough Asubio Pharm Inc. para SKULA fue apoyado por una COMPARTIR becas de doctorado de la Universidad de Copenhague y la UE FP7 proyecto Diabat (SALUD-F2 -2,011-278.373) a Lise Madsen y Kristiansen Karsten. También reconocemos la DERC centro subvención (NIH P30 DK063720).

1. Preparar Medio Digestión Hacer 5 ml por 5 ratones por tejido (aproximadamente 1 ml / 1 g de tejido adiposo). <ol><li> Pesar de las enzimas de digestión: - Colaginasa D: 1,5 u / ml (1108874103, 1 g, Roche, 70334223) - Dispase II: 2,4 u / ml (04942078001, 0.980 mg / lyo, Roche, 11466200) </li><li> Añadir 25 ml de PBS y mezclar bien para disolver </li><li> Añadir CaCl 2 justo antes de la digestión de los tejidos a una concentración final de 10 mM </li></ol><p...

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	<li>Barness, L. A., Opitz, J. M., Gilbert-Barness, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity:+genetic,+molecular,+and+environmental+aspects.">Obesity: genetic, molecular, and environmental aspects.</a> American Journal of Medical Genetics. Part A. 143A, 3016-3034 (2007).</li><li>Rothwell, N. J., Stock, M. 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X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+mitochondrial+biogenesis+is+suppressed+in+db/db+and+high-fat+diet-fed+mice+and+improved+by+rosiglitazone.">Adipose mitochondrial biogenesis is suppressed in db/db and high-fat diet-fed mice and improved by rosiglitazone.</a> Diabetes. 56, 1751-1760 (2007).</li><li>Wilson-Fritch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+remodeling+in+adipose+tissue+associated+with+obesity+and+treatment+with+rosiglitazone.">Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone.</a> The Journal of Clinical Investigation. 114, 1281-1289 (2004).</li><li>Sell, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+agonism+increases+the+capacity+for+sympathetically+mediated+thermogenesis+in+lean+and+ob/ob+mice.">Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonism increases the capacity for sympathetically mediated thermogenesis in lean and ob/ob mice.</a> Endocrinology. 145, 3925-3934 (2004).</li><li>Fukui, Y., Masui, S., Osada, S., Umesono, K., Motojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+thiazolidinedione,+NC-2100,+which+is+a+weak+PPAR-gamma+activator,+exhibits+potent+antidiabetic+effects+and+induces+uncoupling+protein+1+in+white+adipose+tissue+of+KKAy+obese+mice.">A new thiazolidinedione, NC-2100, which is a weak PPAR-gamma activator, exhibits potent antidiabetic effects and induces uncoupling protein 1 in white adipose tissue of KKAy obese mice.</a> Diabetes. 49, 759-767 (2000).</li><li>Vernochet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBPalpha+and+the+corepressors+CtBP1+and+CtBP2+regulate+repression+of+select+visceral+white+adipose+genes+during+induction+of+the+brown+phenotype+in+white+adipocytes+by+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+agonists.">C/EBPalpha and the corepressors CtBP1 and CtBP2 regulate repression of select visceral white adipose genes during induction of the brown phenotype in white adipocytes by peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 4714-4728 (2009).</li><li>Tai, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+nuclear+receptor+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+promotes+brown+adipocyte+differentiation.">Activation of the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor gamma promotes brown adipocyte differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271, 29909-29914 (1996).</li><li>Sugii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPARgamma+activation+in+adipocytes+is+sufficient+for+systemic+insulin+sensitization.">PPARgamma activation in adipocytes is sufficient for systemic insulin sensitization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 22504-22509 (2009).</li></ol>

Aquí presentamos un sistema fiable celular para estudiar el desarrollo de las células de color beige / brite en la enseñanza primaria adipocitos cultivados en ratones. En comparación con varias líneas celulares inmortalizadas disponibles, este sistema es probable que ofrezca mayor relevancia para el pardeamiento de la grasa blanca in vivo. A pesar de que el estudio de estos adipocitos primarios ofrece algunas ventajas, también existen algunas limitaciones y preocupaciones que ...

<html> La obesidad es el aumento dramáticamente en todo el mundo y ahora se considera uno de los problemas más graves para la salud pública 1. Esta condición está relacionada con un desequilibrio en la ingesta de energía relativa a los gastos y resultados en el exceso de energía almacenada en forma de lípidos en el tejido adiposo blanco (WAT). WAT ampliada se asocia con una mayor masa corporal y el peso, mientras que el tejido adiposo marrón tiene la capacidad de disipar el exceso de energía para producir calor. Por lo tanto BAT puede funcionar como protección contra el frío y la obesidad 2,3. Esto se consigue mediante desacoplamiento del transporte de electrones en la mitocondria por la disociación de proteínas 1 (UCP1). Esta proteína se considera una característica de termogénesis sin BAT en 3. Varios estudios realizados en años recientes han revelado que los humanos adultos tienen funcional 4-8 BAT y, en consecuencia, la manipulación de las MTD en los seres humanos puede ser una intervención terapéutica potencial en la lucha contra la obesidad y sus enfermedades relacionadas. jove_content &quot;pruebas&gt; actual indica que hay dos tipos de adipocitos marrones existen en los roedores;&quot; clásica &quot;o&quot; pre-existentes &quot;grasa parda se desarrolla durante la etapa prenatal y forma dedicados depósitos adiposos marrones en región interescapular y otros tejidos periféricos En la otra mano. , un &quot;inducible&quot; forma de grasa marrón (así llamadas células Brite o beige) se desarrolla durante la etapa post-natal y aparece intercaladas en el tejido adiposo blanco. Los dos tipos de adipocitos marrones también son separadas por diferentes orígenes del desarrollo. Si bien la pre-existente adipocitos marrones surgen de myoblastsic-Myf5 como precursores, los inducibles brite / beige células intercaladas en WAT surgen de un linaje no Myf5 9,10. Además, las vías de regulación de este tipo de célula es probable que sea diferente de la marrón Myf5 derivado adipocitos 11. El desarrollo de las células de color beige (es decir, &quot;cambio de color&quot; blanco de grasa) puede ser activada en respuesta a la exposición al frío y crónica aβ3-adrenérgicos agonistas o agonistas de PPAR en adultos 12-14. Las células de color beige / brite es probable que sean un objetivo terapéutico prometedor para la manipulación de balance global de energía y, potencialmente, puede convertirse en parte del tratamiento de la obesidad, por lo que es importante para comprender los mecanismos moleculares precisos y vías de señalización por señales ambientales que controlan el desarrollo de color beige las células. Para comprender el control molecular de la pardeamiento de la grasa blanca, en experimentos in vitro son los más adecuados como la diferenciación de los preadipocitos tiene lugar más bien de forma asíncrona y es difícil de detectar las células in situ 15. Aunque los estudios sobre el desarrollo de los adipocitos hasta ahora se han realizado principalmente en líneas celulares tales como, 3T3-L1 3T3-F442A o HIB1, estas líneas celulares parecen carecer de la firma molecular de las células de color beige. Por otro lado, los adipocitos primarios aislados desde la inyección subcutánea WAT ​​tienen más probabilidades de recapitular los process de pardeamiento de la grasa blanca de forma autónoma celular. Aquí se proporciona un protocolo para el aislamiento eficaz de la fracción estromal-vascular de tejidos adiposos y para inducir el bronceado de grasa blanca en respuesta a los agonistas de PPAR. Rosiglitazona se ha demostrado que es un mediador especialmente eficaz de pardeamiento en estas células. Como se sugirió anteriormente 16, este sistema celular se puede utilizar para servir a un sistema fiable celular para estudiar el desarrollo de las células de color beige / brite.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reactivo </td></tr><tr><td> Colaginasa D </td><td> Roche </td><td> 11088874103 </td><td></td></tr><tr><td> Dispasa II </td><td> Roche </td><td> 04942078001 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Medio DMEM </td><td> Pescador </td><td> 10017-CV </td><td> Con 2,5 g / l de glucosa y L-glutamina sin piruvato de sodio </td></tr><tr><td> Insulina </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> T3 (3,3 &#39;,5-triyodo-L-tironina) </td><td> Sigma </td><td> T-2877 </td><td></td></tr><tr><td> La indometacina </td><td> Sigma </td><td> I-7378 </td><td></td></tr><tr><td> Dexametasona </td><td> Sigma </td><td> D-1756 </td><td></td></tr><tr><td> IBMX </td><td> Sigma </td><td> I-5879 </td><td></td></tr><tr><td> Rosiglitazona </td><td> Sigma </td><td> R-2408 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipo </td></tr><tr><td> Colágeno platos recubiertos </td><td> BD </td><td> 354450 </td><td> Placas de 10 cm </td></tr><tr><td> 70 micras filtro </td><td> BD Falcon </td><td> 352350 </td><td> Celular colador, 70 m nylon 1/ea </td></tr></tbody></table>

isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells

Adipocitos marrones tienen la capacidad de desacoplar la cadena respiratoria en las mitocondrias y disipar la energía química en forma de calor. Desarrollo de UCP1-positivas adipocitos marrones en los tejidos adiposos blancos (llamados células beige o brite) se induce por una variedad de señales ambientales tales como la exposición al frío crónica o por agonistas PPAR, por lo tanto, este tipo de célula tiene potencial como una diana terapéutica para tratamiento de la obesidad. Aunque la mayoría de inmortalizadas líneas de adipocitos no puede recapitular el proceso de &quot;color&quot; de la grasa blanca en cultivo, adipocitos primarios aislados de la fracción del estroma vascular en el tejido subcutáneo adiposo blanco (WAT) proporcionar un sistema celular fiable para estudiar el control molecular de desarrollo de las células beige / brite . Aquí se describe un protocolo para el aislamiento eficaz de los preadipocitos primarios y para inducir la diferenciación de células de color beige / brite en cultivo. El efecto de dorado se puede evaluar mediante la expresión de la grasa marrón selectivo marcaERS tales como UCP1.

Browning de adipocitos primarios se puede acceder mediante la medición de la expresión de ARNm de UCP1 y otros genes de la grasa marrón-específicos o selectivos de QRT-PCR. Presentado en la Figura 1 son los datos de expresión génica en el inguinal-derivados adipocitos primarios. Las células fueron inducidas a diferenciarse en la presencia de dos diferentes dosis de rosiglitazona en 50 nm y 500 nm, respectivamente. Un subconjunto de células se trató con forskolina en 10 mM durante 4 hor...

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Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Preadipocitos primarios blancas aisladas de tejidos adiposos blancos en ratones se pueden diferenciar en células beige / brite. Se presenta aquí un sistema fiable modelo celular para estudiar la regulación molecular de &quot;color&quot; de la grasa blanca.

Aislamiento y diferenciación de las células del estroma vascular a células Beige / Brite

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Aislamiento y suero animal expansión libre de cordón umbilical humano derivado de células mesenquimales del estroma (MSC) y endoteliales formadoras de colonias Células Progenitoras (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Investigación

Biología

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Inducción y Análisis de epitelial a mesenquimal de transición

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Aislamiento y cultivo primario de células endoteliales aórticas de ratón

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Aislamiento de CD146<sup&gt; +</sup&gt; Las células estromales mesenquimales de pulmón Residente de los pulmones de ratas

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Aislamiento de murino coronaria células musculares lisas vasculares

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxina Microinyección en pez cebra para modelar la lesión renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Una interfaz gráfica de usuario para el seguimiento asistido por software de la concentración de proteínas en protones dinámicos celulares

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Aislamiento, caracterización y diferenciación de células cardiacas desde el corazón de ratón adulto

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

Aislamiento, proliferación y diferenciación de células madre derivadas de tejido adiposo de macaco rhesus

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Aislamiento de miocitos aurículas y ventriculares murinas de alta calidad para mediciones simultáneas de transitorios de Ca2+ y corriente de calcio tipo L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...