Name: mitochondria-associated er membranes (mams) and glycosphingolipid enriched microdomains (gems): isolation from mouse brain
Uploaded: 2013-03-04T12:15:00
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Reconocemos la contribución de Renata Sano en la concepción del protocolo inicial. Ad&#39;A. contiene los joyeros de la Infancia (JFC) Cátedra de Genética y Terapia Génica. Este trabajo fue financiado en parte por el NIH subvenciones GM60905, DK52025 y CA021764, y los americanos libaneses Caridades sirios asociados (ALSAC).

<html> El siguiente protocolo está diseñado para el aislamiento y purificación de MAM y gemas de cerebro de ratón Soluciones necesario para el aislamiento de las mitocondrias, MAM y gemas Fraccionamiento de obtener preparación mitocondrial crudo: Solución A: 0,32 M sacarosa, 1 mM NaHCO 3, 1 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl 2 + Inhibidores de la proteasa (añada fresca, según sea necesario) </...

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	<li>Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organellar+junctions+promote+targeted+Ca2++signaling+in+smooth+muscle:+why+two+membranes+are+better+than+one.">Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one.</a> Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).</li><li>Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+rafts+determine+clustering+of+STIM1+in+endoplasmic+reticulum-plasma+membrane+junctions+and+regulation+of+store-operated+Ca2++entry+(SOCE.">Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE.</a> J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).</li><li>Levine, T., Rabouille, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum:+one+continuous+network+compartmentalized+by+extrinsic+cues.">Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).</li><li>Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d'Azzo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM1-ganglioside+accumulation+at+the+mitochondria-associated+ER+membranes+links+ER+stress+to+Ca(2+)-dependent+mitochondrial+apoptosis.">GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis.</a> Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).</li><li>Raturi, A., Simmen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Where+the+endoplasmic+reticulum+and+the+mitochondrion+tie+the+knot:+The+mitochondria-associated+membrane+(MAM).">Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM).</a> Biochim. Biophys. Acta. , (2012).</li><li>Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+link+between+the+mitochondrial+network+and+the+endoplasmic+reticulum.">Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).</li><li>d'Azzo, A., Tessitore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sano+Gangliosides+as+apoptotic+signals+in+ER+stress+response.">Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response.</a> Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).</li><li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+permeabilization+in+cell+death.">Mitochondrial membrane permeabilization in cell death.</a> Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).</li><li>Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdomains+with+high+Ca2++close+to+IP3-sensitive+channels+that+are+sensed+by+neighboring+mitochondria.">Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria.</a> Science. 262, 744-747 (1993).</li><li>Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylated+TMX+and+calnexin+target+to+the+mitochondria-associated+membrane.">Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane.</a> EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).</li><li>Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cholesterol+in+the+association+of+endoplasmic+reticulum+membranes+with+mitochondria.">The role of cholesterol in the association of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 417 (1), 635-639 (2012).</li><li>Grimm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ER-mitochondria+interface:+the+social+network+of+cell+death.">The ER-mitochondria interface: the social network of cell death.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).</li><li>Vance, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+synthesis+in+a+membrane+fraction+associated+with+mitochondria.">Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 265, 7248-7256 (1990).</li><li>Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria-associated+membranes+and+mitochondria+from+animal+tissues+and+cells.">Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells.</a> Nat. Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).</li><li>Pizzo, P., Viola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+lipid+rafts:+structure+and+function.">Lymphocyte lipid rafts: structure and function.</a> Curr. Opin. Immunol. 15 (3), 255-260 (2003).</li></ol>

Los sitios de contacto entre las membranas intracelulares o entre orgánulos y la membrana plasmática de las células dinámicas representan plataformas de señalización para los procesos celulares básicos. La caracterización exacta de su función y composición, tanto en condiciones fisiológicas como patológicas requiere protocolos de purificación fiables y reproducibles. Los métodos detallados aquí han sido específicamente optimizada por nuestro laboratorio para el aislamiento y purificación de los MAM y su...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> REACTIVOS </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Fraccionamiento </td></tr><tr><td> Sacarosa </td><td> Fisher Scientific </td><td> S5-500 </td><td></td></tr><tr><td> Bicarbonato de Sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-5761 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de magnesio, hexahidratado </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de calcio, dihidrato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C-5080 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> MAM </td></tr><tr><td> D-Manitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9546-250G </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP310-500 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E4378-250G </td><td></td></tr><tr><td> BSA, fracción V, choque térmico, liofilizado </td><td> Roche </td><td> 03-116-964-001 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE </td><td> 17-0891-02 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> GEM </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9284-500 ml </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de Sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> Roche </td><td> 03-118-142-001 </td><td></td></tr><tr><td> HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144S-500 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> EDTA </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dodecil sulfato de sodio (SDS) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP166-500 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Común </td></tr><tr><td> Inhibidores de Proteasa Tablets, Complete EDTA libre </td><td> Roche </td><td> 11-873-580-001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPO </td></tr><tr><td> 2 ml Douce All-Glass Grinders tejido </td><td> Kimble Chase </td><td> 885300-0002 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tubos de polipropileno cónicos de centrífuga, BD Falcon </td><td> BD </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 30 ml de fondo redondo de vidrio Tubos centrífuga </td><td> Kimble Chase </td><td> 45500-30 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml de fondo redondo de vidrio CentriTubos Fuge </td><td> Kimble Chase </td><td> 45500-15 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de ultracentrífuga, con claridad, espesores, mm 14x89 </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 344059 </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Cole-Parmer </td><td> PM996 </td><td></td></tr><tr><td> Disposable vidrio borosilicato Pipetas Pasteur, 9 &quot; </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-20C </td><td></td></tr></tbody></table>

mitochondria-associated er membranes (mams) and glycosphingolipid enriched microdomains (gems): isolation from mouse brain

Orgánulos intracelulares son estructuras altamente dinámicas con diferentes forma y composición, que son sometidos a células específicas de señales intrínsecas y extrínsecas. Sus membranas son a menudo yuxtapuestos en sitios de contacto definidas, que se convierten en los cubos para el intercambio de moléculas de señalización y los componentes de membrana 1,2,3,4. Los inter-organellar microdominios de membrana que se forman entre el retículo endoplasmático (ER) y la mitocondria en la apertura de la Ca IP3-2 sensible son conocidos canal + como las mitocondrias asociado-ER membranas o MAMS 4,5,6. La composición de proteína / lípido y propiedades bioquímicas de estos sitios de membrana de contacto han sido ampliamente estudiados en particular en relación con su papel en la regulación intracelular de Ca 2 + 4,5,6. El ER sirve como el almacén principal de la concentración de Ca 2 +, y en esta capacidad regula una gran variedad de procesos celulares aguas abajo de Ca 2 + señalización, including post-traduccional plegamiento de la proteína y proteína maturation7. Las mitocondrias, por otra parte, mantener la homeostasis del Ca 2 +, por la precarga de concentración citosólica de Ca 2 + evitando de este modo la iniciación de las vías de apoptosis aguas abajo de Ca 2 + desequilibrio 4,8. La naturaleza dinámica de los mames hace sitios ideales para diseccionar los mecanismos básicos celulares, incluyendo Ca 2 + señalización y regulación mitocondrial de Ca 2 + concentración supervivencia, la biosíntesis de lípidos y el transporte, la energía y el metabolismo celular 4,9,10,11,12. Varios protocolos se han descrito para la purificación de estos microdominios de tejido hepático y células cultivadas 13,14. Tomando los métodos publicados anteriormente en cuenta, se ha adaptado un protocolo para el aislamiento de las mitocondrias y MAM desde el cerebro de ratón adulto. Para este procedimiento se ha agregado una etapa de purificación adicional, a saber, una extracción de Triton X100, que enables el aislamiento de la glicoesfingolípido enriquecido microdominio (GEM) de la fracción de los mames. Estas preparaciones GEM comparten varios componentes de proteínas con balsas caveolas y lípidos, derivados de la membrana de plasma u otras membranas intracelulares, y se proponen para funcionar como puntos de encuentro para el agrupamiento de proteínas receptoras y para las interacciones proteína-proteína 4,15.

Basándonos en nuestra experiencia con el uso de este protocolo con seguridad puedo recomendar para el aislamiento y purificación de MAM, gemas y fracciones mitocondriales de cerebro de ratón. El procedimiento presentado es altamente reproducible y consistente. En la Figura 1 se muestra una imagen representativa de la forma pura capa de mitocondrias y MAM en un gradiente de Percoll (paso 3,4). De una banda definida, lechoso que contiene purificó mitocondrias (Mito-P) se segrega en la parte inferior d...

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Mitochondria-associated ER Membranes MAMs and Glycosphingolipid Enriched Microdomains GEMs: Isolation from Mouse Brain

Este procedimiento muestra cómo aislar del cerebro del ratón adulto las membranas de las mitocondrias ER-asociados o mams y los glucoesfingolípidos fracciones enriquecidas microdominio de MAM y preparaciones mitocondriales.

Las mitocondrias asociadas ER membranas (MAM) y glicoesfingolípidos microdominios enriquecidos (GEMS): Aislamiento de cerebro de ratón

Intracellular organelles are highly dynamic structures with varying shape and composition, which are subjected to cell-specific intrinsic and extrinsic ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Aislamiento y cultivo de células endoteliales del cerebro anterior embrionarias

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Investigación

Neurociencias

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Aislamiento de CA1 nucleares enriquecidos fracciones de hipocampo rebanadas para estudiar la actividad dependiente Nuclear importación de proteínas mensajeras Synapto nucleares

Studying activity dependent protein expression, subcellular translocation, or phosphorylation is essential to understand the underlying cellular ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Aislamiento de los capilares cerebrales del cerebro humano fresco tejido

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Aislamiento y extracción de ARN de las neuronas, macrófagos y Microglia de cerebros de larvas de pez cebra

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

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Aislamiento de microglia específica de la región del hemisferio cerebral de un ratón adulto para la secuenciación profunda del ARN de una sola célula

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Studying Pre-formed Fibril Induced &#945;-Synuclein Accumulation in Primary Embryonic Mouse Midbrain Dopamine Neurons

Estudio de la acumulación preformada de la dopamina fibril-sinucleina en las neuronas de dopamina de cerebro medio del ratón embrionario primario

The goal of this protocol is to establish a robust and reproducible model of &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons. Combined with ...

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