Name: mitochondria-associated er membranes (mams) and glycosphingolipid enriched microdomains (gems): isolation from mouse brain
Uploaded: 2013-03-04T12:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mitochondria-associated ER Membranes MAMs and Glycosphingolipid Enriched Microdomains GEMs: Isolation from Mouse Brain at JoVE.com

Vi erkänner bidrag Renata Sano i utformningen den första protokollet. Ad&#39;A. håller Juvelerare Till barn (JFC) Utrustad professur i genetik och genterapi. Detta arbete har finansierats delvis av NIH bidrag GM60905, DK52025 och CA021764, och de amerikanska libanesiska syriska associerade välgörenhetsorganisationer (ALSAC).

<html> Följande protokoll är avsett för isolering och rening av MAMS och ädelstenar från mushjärna Lösningar som krävs för isolering av mitokondrier, MAMS och pärlor Fraktionering för att erhålla rå mitokondriell förberedelser: Lösning A: 0,32 M sackaros, 1 mM NaHCOa 3, 1 mM MgClj 2, 0,5 mM CaCla 2 + Proteashämmare (tillsätt färsk, efter behov) <p class="jove_content"...

<ol>
	<li>Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organellar+junctions+promote+targeted+Ca2++signaling+in+smooth+muscle:+why+two+membranes+are+better+than+one.">Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one.</a> Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).</li><li>Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+rafts+determine+clustering+of+STIM1+in+endoplasmic+reticulum-plasma+membrane+junctions+and+regulation+of+store-operated+Ca2++entry+(SOCE.">Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE.</a> J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).</li><li>Levine, T., Rabouille, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum:+one+continuous+network+compartmentalized+by+extrinsic+cues.">Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).</li><li>Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d'Azzo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM1-ganglioside+accumulation+at+the+mitochondria-associated+ER+membranes+links+ER+stress+to+Ca(2+)-dependent+mitochondrial+apoptosis.">GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis.</a> Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).</li><li>Raturi, A., Simmen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Where+the+endoplasmic+reticulum+and+the+mitochondrion+tie+the+knot:+The+mitochondria-associated+membrane+(MAM).">Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM).</a> Biochim. Biophys. Acta. , (2012).</li><li>Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+link+between+the+mitochondrial+network+and+the+endoplasmic+reticulum.">Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).</li><li>d'Azzo, A., Tessitore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sano+Gangliosides+as+apoptotic+signals+in+ER+stress+response.">Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response.</a> Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).</li><li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+permeabilization+in+cell+death.">Mitochondrial membrane permeabilization in cell death.</a> Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).</li><li>Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdomains+with+high+Ca2++close+to+IP3-sensitive+channels+that+are+sensed+by+neighboring+mitochondria.">Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria.</a> Science. 262, 744-747 (1993).</li><li>Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylated+TMX+and+calnexin+target+to+the+mitochondria-associated+membrane.">Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane.</a> EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).</li><li>Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cholesterol+in+the+association+of+endoplasmic+reticulum+membranes+with+mitochondria.">The role of cholesterol in the association of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 417 (1), 635-639 (2012).</li><li>Grimm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ER-mitochondria+interface:+the+social+network+of+cell+death.">The ER-mitochondria interface: the social network of cell death.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).</li><li>Vance, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+synthesis+in+a+membrane+fraction+associated+with+mitochondria.">Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 265, 7248-7256 (1990).</li><li>Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria-associated+membranes+and+mitochondria+from+animal+tissues+and+cells.">Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells.</a> Nat. Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).</li><li>Pizzo, P., Viola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+lipid+rafts:+structure+and+function.">Lymphocyte lipid rafts: structure and function.</a> Curr. Opin. Immunol. 15 (3), 255-260 (2003).</li></ol>

De områden av kontakt mellan intracellulära membran eller mellan organeller och plasmamembranet av celler representerar dynamiska signalering plattformar för grundläggande cellulära processer. Den exakta karakteriseringen av deras funktion och sammansättning under både fysiologiska och patologiska tillstånd kräver tillförlitliga och reproducerbara reningsprotokoll. De metoder som beskrivs här har särskilt optimerats av vårt labb för isolering och rening av MAMS och deras motsvarande pärlor från vuxen mus...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på reagens / material </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> REAGENSER </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Fraktionering </td></tr><tr><td> Sackaros </td><td> Fisher Scientific </td><td> S5-500 </td><td></td></tr><tr><td> NATRIUMBIKARBONAT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-5761 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesiumklorid, hexahydrat </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> Kalciumklorid, dihydrat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C-5080 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> MAM </td></tr><tr><td> D-mannitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9546-250G </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP310-500 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E4378-250G </td><td></td></tr><tr><td> BSA, fraktion V, värmechock, lyofilisat </td><td> Roche </td><td> 03-116-964-001 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE </td><td> 17-0891-02 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> PÄRLA </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9284-500 ml </td><td></td></tr><tr><td> NATRIUMKLORID </td><td> Fisher Scientific </td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> Roche </td><td> 03-118-142-001 </td><td></td></tr><tr><td> HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144S-500 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> EDTA </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfat (SDS) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP166-500 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Gemensam </td></tr><tr><td> Proteashämmare Tabletter, Komplett EDTA-fria </td><td> Roche </td><td> 11-873-580-001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> UTRUSTNING </td></tr><tr><td> 2 ml Douce helt i glas Tissue Grinders </td><td> Kimble Chase </td><td> 885300-0002 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml Polypropylen koniska centrifugrör, BD Falcon </td><td> BD </td><td> 352.097 </td><td></td></tr><tr><td> 30 ml rundbottnad Glass Centrifugrör </td><td> Kimble Chase </td><td> 45.500-30 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml rundbottnad Glass CentriFuge Rör </td><td> Kimble Chase </td><td> 45.500-15 </td><td></td></tr><tr><td> Ultracentrifug rör, Ultra-Klar, Thinwall, 14x89 mm </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 344.059 </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Cole-Parmer </td><td> PM996 </td><td></td></tr><tr><td> Disponibel Borosilicate Glass Pasteur pipetter, 9 &quot; </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-20C </td><td></td></tr></tbody></table>

mitochondria-associated er membranes (mams) and glycosphingolipid enriched microdomains (gems): isolation from mouse brain

Intracellulära organeller är mycket dynamiska strukturer med varierande form och sammansättning, som utsätts för cellspecifika inre och yttre signaler. Deras membran är ofta intill varandra vid definierade kontakt ställen som blir nav för utbyte av signalmolekyler och komponenter membran 1,2,3,4. De inter-organellar membran mikroområden som bildas mellan det endoplasmatiska nätverket (ER) och mitokondrier vid öppnandet av IP3-känsliga Ca 2 +-kanal är kända som mitokondrier tillhörande-ER membran eller MAMS 4,5,6. Proteinet / lipidkompositionen och biokemiska egenskaperna hos dessa platser membran kontakt har studerats utförligt särskilt i förhållande till deras roll vid reglering intracellulär Ca2 + 4,5,6. ER tjänar som den primära förråd av intracellulär Ca 2 +, och i denna egenskap reglerar en myriad av cellulära processer nedströms av Ca 2 +-signalering, inkluding post-translationell proteinveckning och protein maturation7. Mitokondrier, å andra sidan, upprätthålla Ca 2 + homeostas, genom att buffra cytosolisk Ca 2 + koncentrationen därigenom förhindra initieringen av apoptotiska vägar nedströms av Ca 2 + obalans 4,8. Den dynamiska natur MAMS gör dem idealiska platser att dissekera grundläggande cellulära mekanismer, däribland Ca 2 + signalering och reglering av mitokondriell Ca 2 + koncentrationen, lipid biosyntes och transport, energi metabolism och cellöverlevnad 4,9,10,11,12. Flera protokoll har beskrivits för reningen av dessa mikrodomäner från levervävnad och odlade celler 13,14. Med tidigare publicerade metoder i beaktande, har vi anpassat ett protokoll för isolering av mitokondrier och MAMS från vuxen mus hjärnan. Detta förfarande har vi lagt till en extra reningssteg, nämligen en Triton X100 extraktion, vilket enables isolering av glykosfingolipid berikade microdomain (GEM) bråkdel av MAMS. Dessa beredningar GEM delar flera proteinkomponenter med caveolae och lipidaggregat, härledda från plasmamembranet eller andra intracellulära membran, och föreslås att fungera som samla poäng för klustring av receptorproteiner och för protein-proteininteraktioner 4,15.

Baserat på vår erfarenhet med att använda detta protokoll vi tryggt kan rekommendera det för isolering och rening av MAMS, ädelstenar och mitokondriella fraktioner från mus hjärna. Det förfarande som anges är mycket reproducerbar och konsekvent. I figur 1 visar vi en representativ bild av hur ren mitokondrier och MAMS skikt på en Percoll-gradient (steg 3,4). En definierad, mjölkaktig band innehållande renat mitokondrier (Mito-P) segregerar vid botten av röret ultracentrifugen, medan MAM fra...

Watch this Scientific Journal Video about Mitochondria-associated ER Membranes MAMs and Glycosphingolipid Enriched Microdomains GEMs: Isolation from Mouse Brain at JoVE.com

Mitochondria-associated ER Membranes MAMs and Glycosphingolipid Enriched Microdomains GEMs: Isolation from Mouse Brain

Denna procedur visar hur du isolera från den vuxna musen hjärnan mitokondrierna-associerade ER membran eller MAMS och glykosfingolipid-berikade microdomain fraktioner från MAMS och mitokondriella preparat.

Mitokondrier-associerade ER Membran (MAMS) och glykosfingolipid berikat mikroområden (GEMS): Isolering från mushjärna

Intracellular organelles are highly dynamic structures with varying shape and composition, which are subjected to cell-specific intrinsic and extrinsic ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolering och odling av endotelceller från embryonal framhjärnan

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins

Isolering av CA1 Nuclear anrikade Fraktioner från hippocampus skivor att studera aktivitetsberoende Nuclear Import av Synapto-nukleära Messenger Proteiner

Studying activity dependent protein expression, subcellular translocation, or phosphorylation is essential to understand the underlying cellular ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Isolering av Cerebral kapillärerna från färska mänsklig hjärnvävnad

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Isolering och RNA-extraktion av nervceller, makrofager och mikroglia från Larval zebrafiskar hjärnor

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Isolering av regionspecifika Microglia från en vuxen mus hjärnhalva halvklotet för djup Single-cell RNA sekvensering

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Studying Pre-formed Fibril Induced &#945;-Synuclein Accumulation in Primary Embryonic Mouse Midbrain Dopamine Neurons

Studera Förbildad Fibril inducerad α-synuclein ackumulering i primär embryonal mus midbrain dopamin nervceller

The goal of this protocol is to establish a robust and reproducible model of &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons. Combined with ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

Dissektion och isolering av Murine Glia från flera regioner i centrala nervsystemet

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model

En fibrinberikad och tPA-känslig fototrombotisk strokemodell

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent ...

Kvantifiering av mushjärnhistonmodifiering med hjälp av flödescytometri

Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia

Författare i fokus: Förbättringar i forskning om reglering av genuttryck

Kvantifiering av globala histonförändringar efter translationella modifieringar med hjälp av intranukleär flödescytometri i isolerade mikroglia i mushjärna

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to ...