Name: rapid colorimetric assays to qualitatively distinguish rna and dna in biomolecular samples
Uploaded: 2013-02-04T09:51:00
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Diese Arbeit wurde von der University of Virginia und der Jeffress Memorial Trust (J-971) finanziert. Wir danken L. Columbus, K. Jain, und P. Randolph für hilfreiche Diskussionen und die kritische Durchsicht des Manuskripts.

Ein. Benedikt Assay für reduzierende Zucker <ol><li> Bereiten Sie eine geeignete Menge von Benedict-Reagenz - 940 mM wasserfreies Natriumcarbonat, 588 mM Natriumcitrat-Dihydrat, 68 mM Kupfer (II)-Sulfat-Pentahydrat. Dieses Reagenz kann bei Raumtemperatur (RT) für mindestens sechs Monate ohne merkliche Änderung der Reaktivität gespeichert werden. </li><li> Das obige Reagenz 6x. So 600 ul Reaktionen, mit 100 ul von Benedikt-Reagenz ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (zB Eppendorf-Marke), pro Prob...

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	<li>De Mey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+DNA+and+RNA+quantification+methods+suitable+for+parameter+estimation+in+metabolic+modeling+of+microorganisms.">Comparison of DNA and RNA quantification methods suitable for parameter estimation in metabolic modeling of microorganisms.</a> Anal. Biochem. 353, 198-203 (2006).</li><li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoDrop+Microvolume+Quantitation+of+Nucleic+Acids.">NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids.</a> J. Vis. Exp. (45), e2565 (2010).</li><li>Ausubel, F. 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<html> Die kolorimetrische Assays hier vorgestellten bieten eine einfache Ansatz rasch beurteilt die chemische Natur der biomolekularen Mischungen, wie sie beispielsweise auftreten, wenn Reinigung von Proteinen, RNAs oder-Komplexen aus Ganzzellen-Lysat in Vorbereitung für weitere Studien. Als Strukturbiologie verfolgt mehr native-like Baugruppen zunehmend größeren Herausforderungen wie Probe Heterogenität wird durch die komplizierte und Mehrkomponenten-Komplexen gestellt werden. Supramolekularen Aggregate sind oft nu...

Ein Großteil der Zellbiologie erfolgt über molekulare Wechselwirkungen zwischen DNA und RNA. 4 Diese natürlich vorkommenden Nukleinsäuren (NA) miteinander zusammenwirken, 5 mit Proteinen, 6 und mit einer Vielzahl von niedermolekularen Verbindungen und Liganden in vivo (zB divalente Kationen 7). Die Wechselwirkungen können kurz-oder langlebig (kinetisch), können von hohen Bereich zu geringe Affinität (thermodynamische Kraft) moderieren und können zeigen auch erhebliche Unterschiede in den chemischen Eigenschaften und Spezifität - einige Verbände sind recht spezifisch (zB DNA · · · Transkriptionsfaktoren, RNA · · · Spleißfaktoren), während andere Kommunikationen notwendigerweise weit mehr generische (zB DNA · · · bakteriellen histonähnliche HU-Proteine ​​8). Nicht-spezifische Interaktionen mit NAs können praktische Konsequenzen für in vitro Experimente mit Mischungen von biomolecules, da es möglich und sogar wahrscheinlich ist, dass einige NAs wird mit den Biomoleküle von Interesse zu verbinden, zumindest unter gewissen Teilmenge der experimentellen Bedingungen verwendet wird (Ionenstärke, pH usw.). Betrachten wir zum Beispiel Herstellung eines Proteins von Interesse (POI) über heterologe Überexpression des rekombinanten Proteins in Escherichia coli Zellkultur; solches Verfahren wird routinemäßig in praktisch jedem strukturellen Biologielabor durchgeführt 9 In Vorbereitung für weitere Experimente, wie. Als biochemischen / biophysikalischen Charakterisierung, Kristallisation, etc., anfänglichen Bemühungen in der Regel auf die Erzielung einer ausreichenden Menge des POI konzentrieren möglichst reiner Form wie möglich, idealerweise als chemisch homogen und biophysikalisch monodisperse Probe. Nach dem Aufbrechen der Wirtszellen, zielen die frühen Phasen eines typischen Aufreinigung Workflow, um den POI aus E. isolieren coli-Proteine, Nukleinsäuren, Zellwandtrümmern,und andere Komponenten des zellulären Lysat. Jedoch Host NAs kann mit dem POI mehrere physikochemische Gründen co-läutern - ein hochbasisches POI kann unspezifisch Pulldown-Wirts-DNA / RNA, die POI kann ein generisches NA-bindende Aktivität aufweisen (zB die oben erwähnten HU); das POI kann eine ziemlich spezifische NA-Bindungsprotein sondern zeigen Kreuzreaktivität mit Host-RNAs oder DNAs sein; Host NAs kann mit einer Chromatographiematrix wechselwirken und dadurch einfach koeluieren mit dem POI, und so weiter. Willkürliche, hoch-affine Bindung von Host NAs zu einem POI können stellen eine ärgerliche Problem, weil die NA Verunreinigungen wird wahrscheinlich mit nachgeschalteten Experimente (zB Fluoreszenzanisotropie Assays POI • RNA-Bindung 10) stören. Alternativ unerwartete POI · · · NA Verbände können auch zufällig angesehen werden, wie solche Wechselwirkungen beleuchten die POI-Nukleinsäure-bindende Kapazität. So oder so, ob NAs wichtigen Komponenten oder Verunreinigungen sind, muss man zunächst quantifizieren undBestimmung der Art (DNA, RNA) von Co-Reinigungskatalysator NAs in Vorbereitung für nachfolgende Versuche. Mehrere analytischen Methoden existieren zur Detektion und Quantifizierung von NA in einer Probe. Die meisten der verfügbaren Methoden sind grundsätzlich entweder spektrophotometrischen (z. B. A 260 Extinktionswerte und A 260 / A 280-Verhältnisse), fluorometrische (z. B. die Bindung von Thiazolorange oder andere fluoreszierende Farbstoffe auf NA) oder farbmetrisch (Suszeptibilität von Nukleosiden, um chemische Reaktionen Ausbeute daß Chromophore absorbierend im UV-VIS-Bereich des elektromagnetischen Spektrums), wie kürzlich von De Mey et al. 1 Jedoch ist der entscheidende Schritt des Identifizieren des Typs des Polynukleotid, wie RNA oder DNA über den Rahmen viele dieser Quantifizierung Ansätze. Hier bieten wir einen Satz von kolorimetrischen Assays für die schnelle Erkennung der Arten von NA-Komponenten in einem proteinhaltigen Probe. Die hier beschriebenen Protokolle ceine effizient ohne zusätzlichen Schritte der Isolierung der potentiellen NA Verunreinigungen ausgeführt werden, und sich auf Benedikts Assay für reduzierende Zucker 11, das Orcinol-Assay für Pentosen 12,13, 14,15 und Diphenylamin Reaktionen von 2&#39;-deoxypentoses (Abbildungen 1 und 2) . Die Benedikts Test (2a) nutzt die Fähigkeit der linearen, offenkettige (Aldehyd)-Form einer Aldose Zucker zu Cu 2 +, unter Oxidation des Zuckers Carbonylgruppe zu einer Carboxylat-Komponente und Produktion von Cu 2 O als eine Reduzierung unlöslichen roten Niederschlag. Diese Reaktion testen mit freien reduzierenden Zuckern wie Aldosen und Ketosen (die mit den entsprechenden Aldosen über Endiol Zwischenprodukte umzuwandeln) positive, aber nicht mit Pentosezucker, dass in zyklischer Form als Teil der kovalenten Rückgrat eines DNA-oder RNA-Polynukleotid gesperrt. Aufgrund des minimalistischen Erfordernis einer freien Halbacetal Funktionalität, andere Compounds, die positiv getestet werden in diesem Test konnte - und wirken somit als potenzielle Störfaktoren - gehören α-Hydroxy-Ketone und kurze Oligosaccharide (zB das Disaccharid Maltose). Sowohl die Bial Orcin (Abbildung 2b) und Disches Diphenylamin (Abbildung 2c) Reaktionen werden bei der erstmaligen Zerstörung des Polynukleotid Backbone, über Depurinierung der Nukleosid-und weitere Säure-oder Basen-katalysierten Hydrolyse der Muttergesellschaft Nukleotide, die Furan-2 ergeben -carbaldehyd (Furfural) Derivate; diese Derivate reagieren dann entweder mit einem Polyhydroxyphenol wie Orcin (Bial) oder Diphenylamin (Disches) Reagenzien, farbige Kondensationsprodukte von weitgehend unbekannten chemischen Struktur zu bilden. Die DNA im Vergleich zu RNA-Spezifität des Disches Assay beruht auf der Tatsache, daß der Pentosezucker muss 2&#39;-desoxygenierten, um es zu Störungen durch Oxidation zu ω-hydroxylevulinyl Aldehyd, das weiter reagiert mit Diphenylaminunter sauren Bedingungen unter Bildung eines hellblauen Kondensat (Abbildung 2c). Mit den hier beschriebenen Protokolle gestrafft haben wir gefunden, dass diese zuckerfreie spezifischen kolorimetrischen Reaktionen können zwischen RNA und DNA zu unterscheiden, und wird auch auf das Vorhandensein von freien reduzierenden Zucker wie Glucose, Fructose oder Ribose in einer biomolekularen Probe.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenz oder Ausrüstung </td><td> Lieferant / Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentare, Notizen </td></tr><tr><td> Wasserfreies Natriumcarbonat </td><td> Fisher Scientific </td><td> S263 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumcitratdihydrat </td><td> Sigma </td><td> S-4641 </td><td></td></tr><tr><td> Kupfer (II)-Sulfat-Pentahydrat </td><td> VWR </td><td> VW3312-2 </td><td></td></tr><tr><td> Orcinol Monohydrat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O1875 </td><td></td></tr><tr><td> Konzentrierte HCl </td><td> VWR </td><td> BDH3030 </td><td></td></tr><tr><td> Eisenchloridhexahydrat </td><td> Sigma </td><td> F-2877 </td><td></td></tr><tr><td> Diphenylamin </td><td> Aldrich </td><td> 112763 </td><td></td></tr><tr><td> Eisessig </td><td> Fisher Scientific </td><td> A28 </td><td></td></tr><tr><td> Schwefelsäure </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 258105 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Koptec </td><td> V1101 </td><td></td></tr><tr><td> Ribose </td><td> Sigma </td><td> R-7500 </td><td> prep bei 1% w / v in H 2 O </td></tr><tr><td> Ribonukleinsäure aus Bäckerhefe (S. cerevisiae) </td><td> Sigma </td><td> R6750 </td><td> prep bei 10 mg / ml in H 2 O; bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Desoxyribonukleinsäure (Natriumsalz), aus Kalbsthymus </td><td> Sigma </td><td> D1501 </td><td> prep bei 10 mg / ml in H 2 O; lagern bei 4 ° C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagenzien, Geräte und Sicherheit Die Materialien werden in der fo aufgeführtllowing Tabelle in der Reihenfolge, in der sie in dem Protokoll Abschnitt. Soweit nicht anders vermerkt (siehe oben), können alle Reagenzien bei Raumtemperatur und Beleuchtung gespeichert werden. Für alle Posten, die nicht unten aufgeführt (z. B. Mikrozentrifugenröhrchen), kann die übliche Marke / Modell / Sorte fand in einem Standard biochemischen Labor eingesetzt (z. B. Marke Eppendorf 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen) werden. Standard-Kunststoff Mikrozentrifugenröhrchen sollte Schritte, welche Zentrifugation (zB zu sedimentieren Partikelmaterial in der Nähe des Ende jedes Protokoll) verwendet werden. Keine spezielle Material ist bevorzugt, solange die Rohre abzudichten; die typischen Polypropylenröhrchen in Biochemie Laboratorien gefunden funktionieren gut. In Bezug auf die Sicherheit Bedenken und Entsorgung, sollte Standard-Labor-Vorsichtsmaßnahmen (Schutzbrille, Abzugshauben) bei der Aufstellung ausgeübt werden, die Arbeit mit und die Entsorgung von Lösungen mit konzentrierter Essigsäure, Salzsäure oder Schwefelsäure. Für organische Reagenzien wie Orcin oder diphenylamin sind Nitril vorzuziehen gemeinsamen Latex (Naturkautschuk) Vielfalt. </td></tr></tbody></table>

rapid colorimetric assays to qualitatively distinguish rna and dna in biomolecular samples

Biochemischer Experimente in der Regel erfordert genaue Kenntnisse, in einem frühen Stadium, der Nukleinsäure, Protein und anderen biomolekularen Komponenten in potentiell heterogenen Proben. Nukleinsäuren können über mehrere etablierte Methoden, einschließlich analytischen Methoden, die spektrophotometrische sind (z. B. A 260), fluorometrische (z. B. die Bindung von Fluoreszenzfarbstoffe) oder farbmetrisch (Nukleosid-spezifischen chromogenen chemische Reaktionen). 1 Obwohl es nicht leicht unterscheiden kann erkannt werden RNA aus DNA, das A 260 / A 280-Verhältnis wird üblicherweise verwendet, da sie einen einfachen und schnellen 2 Beurteilung der relative Gehalt an Nukleinsäure, die überwiegend in der Nähe 260 nm absorbiert und Protein, das hauptsächlich in der Nähe 280 nm absorbiert bietet. Ratios &lt;0,8 werden als Indikator für die &quot;reinen&quot; Protein Proben entnommen, während reine Nukleinsäure (NA) durch Verhältnisse gekennzeichnet ist&gt; 1,5 3. However, gibt es Situationen, in denen das Protein / NA Gehalt nicht deutlich oder können als zuverlässig abgeleitet von einfachen UV-VIS spektrophotometrische Messungen. Zum Beispiel werden (i) Proben können ein oder mehrere Proteine, die relativ frei von den aromatischen Aminosäuren, die für Absorption bei ≈ 280 nm (Trp, Tyr, Phe) sind, wie es der Fall mit einigen kleinen RNA-bindenden Proteinen und (ii) Proben weisen Zwischenprodukt A 260 / A 280-Verhältnisse (~ 0,8 &lt;~ 1,5), wo das Protein / NA Inhalt ist weit weniger klar und kann sogar auf eine gewisse hoher Affinität Zusammenhang zwischen dem Protein und NA-Komponenten. Für derartige Szenarien beschreiben wir hier eine Reihe von kolorimetrischen Assays rasch unterscheiden RNA, DNA und reduzierende Zucker in einer potentiell Mischprobe von Biomolekülen. Die Methoden beruhen auf der Differenz Empfindlichkeit der Pentosen und andere Kohlenhydrate Benedikt, Bial (Orcin) und Disches (Diphenylamin) Reagenzien, die gestrafft Protokolle com seinabgeschlossen innerhalb weniger Minuten, ohne irgendwelche zusätzlichen Schritte aufweist, um die Komponenten zu isolieren. Die Assays können parallel durchgeführt werden, um zwischen RNA und DNA zu unterscheiden, sowie die Anwesenheit von freien reduzierenden Zucker wie Glucose, Fructose, Ribose und (Abbildung 1).

Die Ergebnisse sind in Abbildung 3 für die Anwendung dieser kolorimetrische Assays bekannt Referenzsubstanzen gezeigt. Vertreter qualitative Daten für die Benedikt (a), Orcin (b) Bial und Disches Diphenylamin (c) Assays gezeigt, und Standard-Kurven für diese drei Tests sind in Abbildung 4 dargestellt. Einsatzplatten 3 (ac) zeigen die linke Felder positive / negative Kontrollexperimente unter Verwendung geeigneter reaktiver / unreaktiv Analyten; diese visuellen Ergebnisse sind in ...

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Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples

Eine Reihe von kolorimetrischen Assays wird zum schnellen Unterscheidungsmerkmal Protein, RNA, DNA und Reduk-tion Zuckern in potentiell heterogenen biomolekularen Proben beschrieben.

Schnelle kolorimetrische Assays zur Qualitativ unterscheiden RNA und DNA in Biomolekulare Proben

Biochemical experimentation generally requires accurate knowledge, at an early stage, of the nucleic acid, protein, and other biomolecular components in ...

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