Name: rapid colorimetric assays to qualitatively distinguish rna and dna in biomolecular samples
Uploaded: 2013-02-04T09:51:00
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यह काम वर्जीनिया विश्वविद्यालय और Jeffress मेमोरियल ट्रस्ट (जे 971) द्वारा वित्त पोषित किया गया था. हम उपयोगी विचार - विमर्श और पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए एल कोलंबस, लालकृष्ण जैन और पी. Randolph धन्यवाद.

1. शक्कर को कम करने के लिए बेनेडिक्ट परख <ol><li> 940 मिमी निर्जल सोडियम कार्बोनेट, 588 मिमी सोडियम साइट्रेट निर्जलीकरण, 68 मिमी तांबे (द्वितीय) सल्फेट Pentahydrate बेनेडिक्ट अभिकर्मक के एक उपयुक्त मात्रा में तैयार करें. ...

<ol>
	<li>De Mey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+DNA+and+RNA+quantification+methods+suitable+for+parameter+estimation+in+metabolic+modeling+of+microorganisms.">Comparison of DNA and RNA quantification methods suitable for parameter estimation in metabolic modeling of microorganisms.</a> Anal. Biochem. 353, 198-203 (2006).</li><li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoDrop+Microvolume+Quantitation+of+Nucleic+Acids.">NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids.</a> J. Vis. Exp. (45), e2565 (2010).</li><li>Ausubel, F. 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<html> वर्णमिति assays यहाँ प्रस्तुत एक सरल दृष्टिकोण की पेशकश करने के लिए तेजी से सामना करना पड़ा जब प्रोटीन RNAs, या आगे के अध्ययन के लिए तैयारी में पूरे सेल lysate से परिसरों सफ़ाई के रूप में biomolecular मिश्रण की रासायनिक...

कोशिका जीव विज्ञान के आणविक डीएनए और आरएनए शामिल बातचीत के माध्यम से होता है 4 ये स्वाभाविक रूप से होने वाली न्यूक्लिक एसिड (NAS) एक दूसरे के साथ बातचीत, प्रोटीन, 6 के साथ और vivo में छोटे अणु यौगिकों और ligands के एक मेजबान के साथ 5 (जैसे, द्विसंयोजक फैटायनों ) 7. बातचीत कम या लंबे समय रहते (kinetically) हो सकता है, उच्च से लेकर कम समानता (thermodynamic शक्ति) करने के लिए उदार हो सकता है और भी रासायनिक गुणों और विशिष्टता में काफी भिन्नता प्रदर्शन कर सकते हैं - कुछ संघों काफी विशिष्ट हैं (उदाहरण के लिए, डीएनए · · प्रतिलेखन कारकों, आरएनए · · splicing) कारक है, जबकि अन्य बातचीत जरूरी कहीं अधिक सामान्य हैं (उदाहरण के लिए, डीएनए · · बैक्टीरियल histone तरह HU 8 प्रोटीन). गैर विशिष्ट Nas के साथ बातचीत के लिए इन विट्रो प्रयोगों में व्यावहारिक परिणाम biomo के मिश्रण को शामिल कर सकते हैंlecules, के रूप में यह संभव है, और होने की संभावना भी है, कि कुछ NAS biomolecules की रुचि का साथ सबसेट प्रयोगात्मक शर्तों के प्रयोग किया जा रहा है कुछ (ईओण ताकत, समाधान पीएच, आदि) के तहत कम से कम, सहयोगी होगा. पर विचार करें, उदाहरण के लिए, Escherichia कोलाई सेल संस्कृति में पुनः संयोजक प्रोटीन के heterologous अभिव्यक्ति के माध्यम से ब्याज (POI) के एक प्रोटीन के उत्पादन, एक ऐसी प्रक्रिया को नियमित रूप से वस्तुतः किसी भी संरचनात्मक जीव विज्ञान प्रयोगशाला में किया जाता है 9 आगे के प्रयोगों के लिए तैयारी में, इस तरह के. जैव रासायनिक / biophysical लक्षण, crystallization, आदि, प्रारंभिक प्रयासों के रूप में आम तौर पर के रूप में संभव के रूप में एक फार्म एक रासायनिक सजातीय और biophysically monodisperse नमूना आदर्श के रूप में शुद्ध, POI की पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने पर ध्यान केंद्रित है. मेजबान कोशिकाओं के विघटन के बाद, एक ठेठ शुद्धि कार्यप्रवाह के प्रारंभिक दौर के लिए ई. से POI को अलग करने के लिए लक्ष्य कोलाई प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड, कोशिका दीवार के मलबे,और सेलुलर lysate के अन्य घटकों. हालांकि, मेजबान NAS कई भौतिक कारणों के लिए POI के साथ सह को शुद्ध कर सकते हैं - एक अत्यधिक बुनियादी POI गैर विशेष रूप से पुल से नीचे डीएनए मेजबान / आरएनए सकता है; POI एक सामान्य गतिविधि NA बाध्यकारी हो सकता है (उदाहरण के लिए, aforementioned HU); POI एक काफी विशिष्ट NA बाध्यकारी लेकिन मेजबान RNAs या DNAs के साथ पार जेट प्रदर्शनी प्रोटीन हो सकता है, मेजबान Nas एक क्रोमैटोग्राफी मैट्रिक्स के साथ बातचीत और जिससे POI के साथ सह - elute बस हो सकता है, और इतने पर. अंधाधुंध, उच्च आत्मीयता मेजबान NAS POI बाध्यकारी एक अप्रिय समस्या खड़ी क्योंकि NA अशुद्धियों की संभावना अनुप्रवाह प्रयोगों (जैसे, प्रतिदीप्ति anisotropy assays POI • शाही सेना बाध्यकारी 10) के साथ हस्तक्षेप करेगा कर सकते हैं. वैकल्पिक रूप से, अप्रत्याशित POI · · NA संघों भी अनायास देखा जा सकता है, के रूप में ऐसी बातचीत POI न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी क्षमता रोशन. किसी भी तरह से, चाहे NAS प्रमुख घटकों या contaminants हैं, एक 1 यों और चाहिए(डीएनए, शाही सेना) अनुप्रवाह प्रयोगों के लिए तैयारी में सह सफ़ाई Nas के प्रकार की पहचान. कई विश्लेषणात्मक तरीकों का पता लगाने और एक नमूने में Nas quantitating के लिए मौजूद हैं. उपलब्ध तरीकों के अधिकांश मौलिक या तो (उदाहरण के लिए, एक 260 absorbance मूल्यों और एक 260/280 अनुपात) spectrophotometric, fluorometric (जैसे, thiazole नारंगी या NA अन्य फ्लोरोसेंट रंजक के बंधन), या वर्णमिति (nucleosides की रासायनिक प्रतिक्रियाओं के लिए संवेदनशीलता कि उपज chromophores विद्युत चुम्बकीय वर्णक्रम के क्षेत्र यूवी तुलना) में अवशोषित, के रूप में हाल ही में De Mey एट अल द्वारा वर्णित है. 1 हालांकि, शाही सेना या डीएनए के रूप में polynucleotide के प्रकार की पहचान के महत्वपूर्ण कदम इन quantitation के कई के दायरे से परे है दृष्टिकोण. यहाँ हम वर्णमिति assays के एक सेट के लिए तेजी से एक प्रोटीनीय नमूना में NA घटकों के प्रकार की पहचान प्रदान करते हैं. प्रोटोकॉल यहाँ ग वर्णितएक कुशलतापूर्वक संभावित NA अशुद्धियों को अलग करने के अतिरिक्त कदम के बिना क्रियान्वित किया जा, और 11 शक्कर, 12,13 pentoses के लिए orcinol परख, और diphenylamine प्रतिक्रियाओं 14,15 2&#39;-deoxypentoses की (1 आंकड़े और 2) को कम करने के लिए बेनेडिक्ट परख पर भरोसा . बेनेडिक्ट परीक्षण (2a चित्रा) रैखिक, एक aldose चीनी की खुली श्रृंखला फार्म (एल्डिहाइड) +, चीनी कार्बोनिल का सहवर्ती ऑक्सीकरण के साथ एक carboxylate आधा भाग और एक के रूप में उत्पादन घन 2 हे 2 घन को कम करने की क्षमता का इस्तेमाल अघुलनशील लाल तलछट. यह प्रतिक्रिया ऐसे aldoses और ketoses (जो enediol मध्यवर्ती के माध्यम से इसी aldoses कनवर्टर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है) के रूप में मुफ्त शर्करा को कम करने के साथ सकारात्मक परीक्षण, लेकिन pentose शर्करा कि चक्रीय रूप में एक डीएनए या शाही सेना polynucleotide के सहसंयोजक रीढ़ की हड्डी के भाग के रूप में बंद कर रहे हैं के साथ नहीं है. Minimalistic एक मुक्त hemiacetal कार्यक्षमता की आवश्यकता है, अन्य सह की वजह सेα-hydroxy mpounds कि इस परख में सकारात्मक परीक्षण कर सकता है - और इसलिए संभावित interferents के रूप में कार्य - ketones और कम oligosaccharides (जैसे disaccharide maltose) शामिल हैं. दोनों Bial orcinol (चित्रा 2b) और Dische diphenylamine प्रतिक्रियाओं (चित्रा 2c) polynucleotide रीढ़ की हड्डी के प्रारंभिक विनाश पर आधारित हैं, न्यूक्लीओसाइड की depurination और आगे एसिड या माता - पिता के nucleotides के आधार उत्प्रेरित hydrolysis के माध्यम से, उपज furan-2 डेरिवेटिव (furfural) carbaldehyde, इन डेरिवेटिव तो या तो एक (Bial) orcinol या diphenylamine (Dische) अभिकर्मकों के लिए बड़े पैमाने पर अज्ञात रासायनिक संरचना के रंग का संक्षेपण उत्पादों फार्म के रूप में इस तरह के phenol polyhydroxy के साथ प्रतिक्रिया. आरएनए विशिष्टता बनाम Dische परख के डीएनए तथ्य यह है कि pentose 2&#39;-deoxygenated चीनी क्रम में ω hydroxylevulinyl एल्डिहाइड, जो आगे diphenylamine के साथ प्रतिक्रिया करता है ऑक्सीकरण, अतिसंवेदनशील होना चाहिए की वजह से उपजीअम्लीय शर्तों के तहत एक चमकदार नीली घनीभूत (चित्रा 2c) उपज. सुव्यवस्थित यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग, हमने पाया है है कि इन चीनी विशिष्ट वर्णमिति प्रतिक्रियाओं शाही सेना और डीएनए के बीच अंतर है, कर सकते हैं और भी ग्लूकोज, fructose, एक biomolecular नमूना में या ribose के रूप में मुफ्त शर्करा को कम करने की उपस्थिति का संकेत होगा.

<table border="1"><tbody><tr><td> अभिकर्मक या उपकरण </td><td> प्रदायक / कंपनी </td><td> कैटलॉग संख्या </td><td> टिप्पणियां नोट, </td></tr><tr><td> निर्जल सोडियम कार्बोनेट </td><td> फिशर साइंटिफिक </td><td> S263 </td><td></td></tr><tr><td> सोडियम साइट्रेट dihydrate </td><td> सिग्मा </td><td> S-4641 </td><td></td></tr><tr><td> कॉपर सल्फेट Pentahydrate (द्वितीय) </td><td> VWR </td><td> VW3312-2 </td><td></td></tr><tr><td> Orcinol monohydrate </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> O1875 </td><td></td></tr><tr><td> केंद्रित एचसीएल </td><td> VWR </td><td> BDH3030 </td><td></td></tr><tr><td> Ferric क्लोराइड hexahydrate </td><td> सिग्मा </td><td> एफ +२८७७ </td><td></td></tr><tr><td> Diphenylamine </td><td> Aldrich </td><td> 112763 </td><td></td></tr><tr><td> हिमनदों एसिटिक एसिड </td><td> फिशर साइंटिफिक </td><td> A28 </td><td></td></tr><tr><td> गंधक का तेजाब </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> 258105 </td><td></td></tr><tr><td> इथेनॉल </td><td> Koptec </td><td> V1101 </td><td></td></tr><tr><td> Ribose </td><td> सिग्मा </td><td> R-7500 </td><td> 1% पर प्रस्तुत करने w / एच 2 हे में ध् </td></tr><tr><td> Ribonucleic एसिड बेकर की खमीर से (एस cerevisiae) </td><td> सिग्मा </td><td> R6750 </td><td> 10 एच 2 हे में मिलीग्राम / मिलीलीटर में प्रस्तुत करने का, -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान </td></tr><tr><td> Deoxyribonucleic एसिड, सोडियम (नमक) बछड़ा थाइमस से </td><td> सिग्मा </td><td> D1501 </td><td> 10 एच 2 हे में मिलीग्राम / मिलीलीटर में प्रस्तुत करने का, 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> अभिकर्मकों, उपकरण, और सुरक्षा सामग्री के लिए में सूचीबद्ध कर रहे हैंllowing तालिका जिस क्रम में वे प्रोटोकॉल अनुभाग में दिखाई देते हैं. जब तक अन्यथा नोट (ऊपर), सभी अभिकर्मकों परिवेश कमरे के तापमान और प्रकाश में संग्रहित किया जा सकता है. किसी भी आइटम के लिए सूचीबद्ध (जैसे, microcentrifuge ट्यूब) के नीचे नहीं, सामान्य बनाने / मॉडल / विविधता एक मानक जैव रासायनिक प्रयोगशाला में पाया (जैसे, Eppendorf ब्रांड 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूबों) का इस्तेमाल किया जा सकता है. मानक प्लास्टिक microfuge ट्यूबों centrifugation (जैसे, तलछट प्रत्येक प्रोटोकॉल का अंत निकट कण सामग्री) से जुड़े कदम के लिए किया जाना चाहिए. कोई विशेष सामग्री बेहतर है, के रूप में लंबे समय के रूप में ट्यूब सील किया जा सकता है, विशिष्ट जैव रसायन प्रयोगशालाओं में पाया polypropylene ट्यूब अच्छी तरह से काम करते हैं. सुरक्षा चिंताओं और अपशिष्ट निपटान के मामले में, मानक प्रयोगशाला सावधानियों (सुरक्षा चश्मा, धूआं डाकू) पूर्व कतरन में प्रयोग किया जाना चाहिए, के साथ काम कर रहे हैं, और केंद्रित एसिटिक, हाइड्रोक्लोरिक या सल्फ्यूरिक एसिड युक्त समाधान का निपटान. इस तरह के रूप में जैविक अभिकर्मकों के लिए orcinol या diphenylamine, nitrile दस्ताने आम (प्राकृतिक रबर) लाटेकस विविधता के लिए बेहतर हैं. </td></tr></tbody></table>

rapid colorimetric assays to qualitatively distinguish rna and dna in biomolecular samples

Biochemical experimentation generally requires accurate knowledge, at an early stage, of the nucleic acid, protein, and other biomolecular components in potentially heterogeneous specimens. Nucleic acids can be detected via several established approaches, including analytical methods that are spectrophotometric (e.g., A260), fluorometric (e.g., binding of fluorescent dyes), or colorimetric (nucleoside-specific chromogenic chemical reactions).1 Though it cannot readily distinguish RNA from DNA, the A260/A280 ratio is commonly employed, as it offers a simple and rapid2 assessment of the relative content of nucleic acid, which absorbs predominantly near 260 nm and protein, which absorbs primarily near 280 nm. Ratios &lt; 0.8 are taken as indicative of 'pure' protein specimens, while pure nucleic acid (NA) is characterized by ratios &gt; 1.53.
However, there are scenarios in which the protein/NA content cannot be as clearly or reliably inferred from simple uv-vis spectrophotometric measurements. For instance, (i) samples may contain one or more proteins which are relatively devoid of the aromatic amino acids responsible for absorption at &asymp;280 nm (Trp, Tyr, Phe), as is the case with some small RNA-binding proteins, and (ii) samples can exhibit intermediate A260/A280 ratios (~0.8 &lt; ~1.5), where the protein/NA content is far less clear and may even reflect some high-affinity association between the protein and NA components. For such scenarios, we describe herein a suite of colorimetric assays to rapidly distinguish RNA, DNA, and reducing sugars in a potentially mixed sample of biomolecules. The methods rely on the differential sensitivity of pentoses and other carbohydrates to Benedict's, Bial's (orcinol), and Dische's (diphenylamine) reagents; the streamlined protocols can be completed in a matter of minutes, without any additional steps of having to isolate the components. The assays can be performed in parallel to differentiate between RNA and DNA, as well as indicate the presence of free reducing sugars such as glucose, fructose, and ribose (Figure 1).

परिणाम ज्ञात संदर्भ यौगिकों के लिए इन वर्णमिति assays के आवेदन के लिए चित्रा 3 में दिखाया जाता है. प्रतिनिधि गुणात्मक डेटा बेनेडिक्ट (एक), Bial orcinol (ख), और Dische diphenylamine assays (ग) के लिए दिखाए जाते हैं, और इन तीन assays के ल?...

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