Name: rapid colorimetric assays to qualitatively distinguish rna and dna in biomolecular samples
Uploaded: 2013-02-04T09:51:00
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Questo lavoro è stato finanziato dalla University of Virginia e del Jeffress Memorial Trust (J-971). Ringraziamo L. Colombo, K. Jain, e P. Randolph per le discussioni utili e la lettura critica del manoscritto.

1. Saggio di Benedetto per la riduzione degli Zuccheri <ol><li> Preparare una quantità adeguata di reattivo di Benedict - 940 carbonato di sodio anidro mM, 588 mM di citrato di sodio diidrato, 68 mM di rame (II) pentaidrato solfato. Questo reagente può essere conservato a temperatura ambiente (RT) per almeno sei mesi senza alcun cambiamento visibile della reattività. </li><li> Il reagente sopra è 6x. Così, per 600 reazioni ul, aggiungere 100 ml di reattivo di Benedict per un ambiente pulito 1,5 ml microcentrifuga...

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	<li>De Mey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+DNA+and+RNA+quantification+methods+suitable+for+parameter+estimation+in+metabolic+modeling+of+microorganisms.">Comparison of DNA and RNA quantification methods suitable for parameter estimation in metabolic modeling of microorganisms.</a> Anal. Biochem. 353, 198-203 (2006).</li><li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoDrop+Microvolume+Quantitation+of+Nucleic+Acids.">NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids.</a> J. Vis. Exp. (45), e2565 (2010).</li><li>Ausubel, F. 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<html> I saggi colorimetrici presentati qui offrono un approccio semplice per valutare rapidamente la natura chimica di miscele biomolecolari, come si incontrano quando purificare proteine, RNA o complessi di cellule intere lisato in preparazione per ulteriori studi. Come biologia strutturale persegue assemblee più nativa, come le sfide progressivamente più grandi, come ad esempio l&#39;eterogeneità del campione, sarà posta dai complessi complesse e multi-componente. Supramolecolari sono spesso solo marginalmente sta...

Molto di biologia cellulare avviene attraverso interazioni molecolari che coinvolgono DNA e RNA. 4 Questi acidi nucleici naturali (AN) interagiscono tra loro, 5, 6 con proteine ​​e con una serie di piccole molecole composti e ligandi in vivo (ad esempio, cationi bivalenti 7). Le interazioni possono essere di breve o di lunga durata (cineticamente), può variare da elevata a moderata a bassa affinità (forza termodinamico), e può anche esporre sostanziale variazione delle proprietà chimiche e specificità - alcune associazioni sono molto specifici (ad esempio, il DNA · · · i fattori di trascrizione, RNA · · · fattori di splicing), mentre le altre interazioni sono necessariamente molto più generico (ad esempio, il DNA · · · batteriche come le proteine ​​istone-HU 8). Non specifiche interazioni con agenzie nazionali possono avere conseguenze pratiche per gli esperimenti in vitro che coinvolgono miscele di biomolecules, in quanto è possibile, e anche probabile, che qualche AN assocerà con le biomolecole di interesse, almeno in alcuni sottoinsieme delle condizioni sperimentali impiegate (forza ionica, pH soluzione, ecc). Si consideri, ad esempio, la produzione di una proteina di interesse (POI) eterologa tramite sovra-espressione della proteina ricombinante in coltura di cellule di Escherichia coli, tale procedura viene eseguita di routine in qualsiasi laboratorio di biologia strutturale 9 Nella preparazione per ulteriori esperimenti, quali. come caratterizzazione biochimica / biofisica, cristallizzazione, ecc., sforzi iniziali in genere in modo di ottenere una sufficiente quantità di POI come pura forma possibile, idealmente come un campione chimicamente omogenea e biofisico, monodisperse. Dopo la rottura di cellule ospiti, le prime fasi di un flusso di lavoro tipico purificazione lo scopo di isolare il POI da E. coli proteine, acidi nucleici, parete detriti cellulari,e altri componenti del lisato cellulare. Tuttavia, AN ospite può co-purificare con il POI per diversi motivi fisico - un POI fortemente basico può non specificamente tendina ospitante DNA / RNA, il POI può avere un generico NA attività di legame (ad esempio, il già citato HU); il POI può essere abbastanza specifico NA-binding protein ma mostra reattività crociata con RNA host o DNAs; ospitante AN può interagire con una matrice di cromatografia e quindi semplicemente co-eluire con il POI, e così via. Indiscriminato, ad alta affinità di legame di host AN verso un PDI può rappresentare un problema fastidioso in quanto le impurità NA probabilmente interferire con gli esperimenti a valle (ad esempio, analisi di anisotropia di fluorescenza di POI • RNA binding 10). In alternativa, POI imprevisto · · · associazioni NA può essere visto anche fortuitamente, come tali interazioni illuminare il POI acido nucleico capacità di legame. In entrambi i casi, se AN sono componenti chiave o contaminanti, si deve prima quantificare eidentificare il tipo (DNA, RNA) di co-purificazione AN in preparazione per esperimenti a valle. Esistono diversi metodi analitici per rilevare e quantificare AN in un campione. La maggior parte dei metodi disponibili sono fondamentalmente o spettrofotometrica (ad esempio, A 260 valori di assorbanza e A 260 / A 280 rapporti), fluorimetrica (ad esempio, il legame di tiazolo arancione o altri coloranti fluorescenti a NA), o colorimetrico (suscettibilità di nucleosidi a reazioni chimiche rendimento che cromofori assorbenti in UV-VIS regione dello spettro elettromagnetico), come recentemente descritto da De Mey et al. 1 Tuttavia, il passo cruciale di identificare il tipo di polinucleotide come RNA o DNA è oltre la portata di molti di questi quantificazione approcci. Qui forniamo una serie di test colorimetrici di individuare rapidamente i tipi di componenti NA in un campione proteico. I protocolli descritti qui cun essere efficacemente eseguito senza ulteriori fasi di isolare le impurità potenziali NA, e si basano su test Benedetto per zuccheri riducenti 11, il saggio di orcinol pentosi 12,13, 14,15 e reazioni difenilammina di 2&#39;-deoxypentoses (figure 1 e 2) . Test del Benedetto (Figura 2a) utilizza la capacità del lineare, forma a catena aperta (aldeide) di zucchero aldosio ridurre Cu 2 +, con concomitante ossidazione del carbonile zucchero di una porzione carbossilato e produzione di Cu 2 O come insolubile precipitato rosso. Questa reazione test positivo con libero zuccheri riducenti come aldosi e chetosi (che convertono le aldosi corrispondenti attraverso intermedi enediol), ma non con zuccheri pentosi che sono bloccati in forma ciclica come parte della spina dorsale covalente di un DNA o RNA polinucleotide. A causa del requisito minimalista di una funzionalità senza emiacetale, altri compounds che potrebbero test positivo in questo saggio - e quindi agiscono come potenziali interferenti - sono α-idrossi-chetoni e oligosaccaridi brevi (ad esempio il maltosio disaccaride). Sia il Bial di orcinol (Figura 2b) e Dische di difenilammina (figura 2c) reazioni sono basate sulla distruzione iniziale del backbone polinucleotide, tramite depurination del nucleoside e acido o ulteriore base-catalizzata idrolisi dei nucleotidi madri, per ottenere furan-2 -carbaldehyde (furfurolo) derivati; questi derivati ​​poi reagire sia con un poliidrossi fenolo come orcinol (Bial) o difenilammina (Dische di) reagenti per formare prodotti di condensazione colorate di struttura chimica in gran parte sconosciute. Il DNA RNA rispetto specificità del test del Dische deriva dal fatto che lo zucchero pentoso deve essere 2&#39;-deossigenata per essere suscettibili di ossidazione per ω-hydroxylevulinyl aldeide, che reagisce ulteriormente con difenilamminain condizioni acide per ottenere un blu brillante condensa (figura 2c). Utilizzando i protocolli semplificati descritti qui, abbiamo trovato che queste reazioni colorimetriche zucchero-specifici può distinguere tra RNA e DNA, e indicherà la presenza di zuccheri riducenti liberi quali glucosio, fruttosio, ribosio o in un campione biomolecolare.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente o attrezzature </td><td> Fornitore / società </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti, note </td></tr><tr><td> Sodio carbonato anidro </td><td> Fisher Scientific </td><td> S263 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio citrato diidrato </td><td> Sigma </td><td> S-4641 </td><td></td></tr><tr><td> Di rame (II) solfato pentaidrato </td><td> VWR </td><td> VW3312-2 </td><td></td></tr><tr><td> Monoidrato orcinol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O1875 </td><td></td></tr><tr><td> HCl concentrato </td><td> VWR </td><td> BDH3030 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro ferrico esaidrato </td><td> Sigma </td><td> F-2877 </td><td></td></tr><tr><td> Difenilammina </td><td> Aldrich </td><td> 112763 </td><td></td></tr><tr><td> Acido acetico glaciale </td><td> Fisher Scientific </td><td> A28 </td><td></td></tr><tr><td> Acido solforico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 258105 </td><td></td></tr><tr><td> Etanolo </td><td> Koptec </td><td> V1101 </td><td></td></tr><tr><td> Ribosio </td><td> Sigma </td><td> R-7500 </td><td> prep a 1% w / v in H 2 O </td></tr><tr><td> L&#39;acido ribonucleico da lievito di birra (S. cerevisiae) </td><td> Sigma </td><td> R6750 </td><td> preparazione a 10 mg / ml in H 2 O, conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> Acido desossiribonucleico (sale sodico), da timo di vitello </td><td> Sigma </td><td> D1501 </td><td> preparazione a 10 mg / ml in H 2 O, conservare a 4 ° C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagenti, strumentazione e sicurezza Materiali sono elencati nella following tabella nell&#39;ordine in cui appaiono nella sezione Protocollo. Se non specificato diversamente (sopra), tutti i reagenti possono essere conservati a temperatura ambiente e l&#39;illuminazione. Per tutti gli articoli non elencati di seguito (per esempio, provette da microcentrifuga), la marca solita / modello / varietà trovato in un laboratorio biochimico di serie può essere utilizzata (ad esempio, di marca Eppendorf da 1,5 ml microcentrifuga tubi). Standard di provette per microcentrifuga plastica deve essere utilizzato per operazioni che coinvolgono centrifugazione (ad esempio, al materiale particolato sedimenti vicino alla fine di ciascun protocollo). Nessuna particolare materiale è preferibile, purché i tubi possono essere sigillata; le provette di polipropilene tipici presenti nei laboratori di biochimica funziona bene. In termini di problemi di sicurezza e di smaltimento dei rifiuti, le precauzioni standard di laboratorio (occhiali di sicurezza, cappe) deve essere esercitata nel pre-sbucciatura, lavorare con, e lo smaltimento di soluzioni contenenti concentrato acetico, cloridrico o solforico. Per i reagenti organici come orcinol o diphenylamine, guanti di nitrile sono preferibili al lattice comune (gomma naturale) varietà. </td></tr></tbody></table>

rapid colorimetric assays to qualitatively distinguish rna and dna in biomolecular samples

Sperimentazione biochimica generalmente richiede una conoscenza accurata, in una fase iniziale, l&#39;acido nucleico, proteine ​​e altri componenti biomolecolari in campioni potenzialmente eterogenei. Gli acidi nucleici possono essere rilevati tramite diversi approcci stabiliti, compresi metodi analitici spettrofotometrico (ad esempio, A 260), fluorometrico (ad esempio, il legame di coloranti fluorescenti), o colorimetrica (nucleoside-specifiche reazioni chimiche cromogeni). 1 Anche se non può facilmente distinguere RNA da DNA, la A 260 / A 280 rapporto è comunemente impiegato, in quanto offre un semplice e rapido 2 valutazione del contenuto relativo di acido nucleico, che assorbe prevalentemente vicino 260 nm e proteine, che assorbe principalmente vicino 280 nm. Rapporti &lt;0,8 sono presi come indicativo di &quot;puri&quot; i campioni di proteine, mentre il puro acido nucleico (NA) è caratterizzata da rapporti di&gt; 1,5 3. HoWever, ci sono scenari in cui la proteina / NA contenuto non può essere nel modo più chiaro e affidabile dedurre da semplici misure spettrofotometriche UV-VIS. Per esempio, (i) i campioni possono contenere una o più proteine ​​che sono relativamente privo degli amminoacidi aromatici responsabili di assorbimento a 280 nm (≈ Trp, Tyr, Phe), come è il caso con alcuni piccoli RNA-binding proteins, e (ii) i campioni possono presentare intermedi A 260 / A 280 rapporti (~ 0.8 &lt;~ 1.5), dove la proteina / NA contenuto è molto meno chiara e può anche riflettere un po &#39;alta affinità associazione tra la proteina e componenti NA. Per tali scenari, si descrive qui una suite di test colorimetrici per distinguere rapidamente RNA, DNA, e zuccheri riduttori in un campione potenzialmente misto di biomolecole. I metodi si basano sulla sensibilità differenziale di pentosi e altri carboidrati a Benedetto, Bial di (orcinol), e di Dische (difenilammina) reagenti; protocolli ottimizzati possono essere comcompletato in pochi minuti, senza ulteriori passaggi di dover isolare i componenti. I saggi possono essere eseguiti in parallelo per distinguere tra RNA e DNA, così come indica la presenza di zuccheri riducenti liberi quali glucosio, fruttosio, ribosio e (Figura 1).

Risultati sono mostrati in Figura 3 per l&#39;applicazione di tali saggi colorimetrici ai composti di riferimento noti. Rappresentativi dati qualitativi sono indicati per il Benedetto (a), orcinol Bial di (b), e Dische di difenilammina (c) saggi, e le curve standard per questi tre saggi sono illustrati nella Figura 4. In pannelli 3 (ac), i pannelli di sinistra mostra positive / negative esperimenti di controllo utilizzando analiti opportunamente reattivi / non reattivi; questi risultati...

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Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples

Una suite di test colorimetrici è descritto per le proteine ​​rapidamente distinguere, RNA, DNA, e la possibilità di ridurre gli zuccheri in campioni biomolecolari potenzialmente eterogenei.

Rapid test colorimetrici per distinguere qualitativamente RNA e del DNA nei campioni Biomolecolari

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