Name: purification and microrna profiling of exosomes derived from blood and culture media
Uploaded: 2013-06-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media at JoVE.com

Questo studio è stato sostenuto da fondi da Rita Allen sovvenzione della Fondazione per Seena Ajit. Gli autori desiderano ringraziare Erika Balogh e Dr. Soumitra Ghoshroy dall&#39;Università di Centro Electron Microscopy South Carolina per l&#39;uso dello strumento, l&#39;assistenza scientifica e tecnica.

Tutti gli esperimenti usando campioni di sangue da uomo e roditori sono stati eseguiti in conformità a tutte le direttive, i regolamenti e le agenzie di regolamentazione. Soggetti umani sono stati arruolati dopo aver dato il consenso informato come approvato dalla Drexel University College of Medicine Institutional Review Board e di tutte le procedure per gli studi condotti su animali sono stati approvati dalla Institutional Animal Care di Drexel e utilizzo Comitato. 1. Purificazione Exosome ...

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	<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+target+recognition+and+regulatory+functions.">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li><li>Mendell, J. T., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+stress+signaling+and+human+disease.">MicroRNAs in stress signaling and human disease.</a> Cell. 148, 1172-1187 (2012).</li><li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-coding+RNAs+in+human+disease.">Non-coding RNAs in human disease.</a> Nature reviews. Genetics. 12, 861-874 (2011).</li><li>Mitchell, P. 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P., Smith, V. L., Karakousis, P. C., Schorey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+isolated+from+mycobacteria-infected+mice+or+cultured+macrophages+can+recruit+and+activate+immune+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Exosomes isolated from mycobacteria-infected mice or cultured macrophages can recruit and activate immune cells in vitro and in vivo.</a> J. Immunol. 189, 777-785 (2012).</li><li>Etheridge, A., Lee, I., Hood, L., Galas, D., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+microRNA:+A+new+source+of+biomarkers.">Extracellular microRNA: A new source of biomarkers.</a> Mutat. Res. , (2011).</li><li>Stenvang, J., Silahtaroglu, A. 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In questo protocollo, mostriamo la quantificazione dei miRNA e mRNA da exosomes purificati mediante centrifugazione differenziale di sangue e di cultura dei media. Exosomes hanno diverse componenti che dipendono dalla loro origine e sono coinvolti in una serie di funzioni biologiche, compresa la risposta immunitaria, presentazione dell&#39;antigene, comunicazione intracellulare, e il trasferimento di RNA e proteine ​​9,11,12,19,20. Mentre la dimensione e la forma è un determinante di purezza exosome, una...

Brevi non codificanti miRNA modulano l&#39;espressione genica legandosi al mRNA bersaglio. Seme sequenza di complementarità ~ 7 coppie di basi miRNA consente di legarsi al mRNA bersaglio conseguente inibizione della traduzione o nella riduzione della stabilità del mRNA, entrambi i quali possono portare a diminuzione dell&#39;espressione della proteina bersaglio 1. La ricerca negli ultimi dieci anni ha inequivocabilmente dimostrato un ruolo fondamentale per il miRNA nel mediare le funzioni cellulari. C&#39;è stato anche un notevole sforzo diretto verso la dissezione miRNA cambiamenti molecolari alla base di diverse malattie mediate 2,3. Inoltre, la recente identificazione di miRNA stabili in fluidi corporei 4-6 aperto la strada per il loro uso come nuovi biomarcatori suscettibili di diagnosi clinica. Un modo di trasporto miRNA nei fluidi corporei è via exosomes, piccole vescicole che trasportano mRNA, proteine, mediatori lipidici, e miRNA alle cellule riceventi tramite cir arteriosa sistemicaione 7-14. Ciò si traduce in modulazione dell&#39;espressione genica in cellule riceventi e rappresenta un nuovo meccanismo di comunicazione cellulare. Per esempio, le cellule possono modulare processi immuno-regolatori secernendo e / o exosomes assorbenti contenenti biomolecole coinvolte nella infiammazione, come interleuchina-1β (IL1β), fattore di necrosi tumorale-α (TNFa), fattore di crescita trasformante-β5 (TGFβ5), e i miRNA che regolano questi geni 13. Come espressione di miRNA aberrante è una caratteristica comune in una varietà di malattie umane, queste molecole offrono nuove interessanti opportunità per la scoperta e la validazione di nuovi bersagli terapeutici 2. MicroRNA circolanti sono presenti in tutti i fluidi corporei ed è noto che la composizione del exosomes è diverso in base alle celle di origine da cui sono stati rilasciati. Così essi offrono una via per studiare lo stato fisiologico delle cellule e come le cellule cambiano a segnalazione anchets in risposta a stress comprese malattie. Studiare le alterazioni nella composizione exosome può fornire indicazioni in trasduzione del segnale e studiare il loro potenziale utilità come biomarcatori o percorsi di intervento terapeutico. Qui dimostreremo la purificazione exosomes provenienti da fonti multiple basate su protocolli pubblicati. Questi exosomes saranno utilizzati per l&#39;isolamento dell&#39;RNA seguito da qPCR per identificare e misurare i livelli di miRNA presenti nelle exosomes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA coated vacutainer (10 ml tubes)</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>366643</td>
 <td>For exosome purification from human blood</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA coated vacutainer (2 ml tubes)</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>367841</td>
 <td>For exosome purification from mouse blood</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PAXgene Blood RNA Tube</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>762165</td>
 <td>For miRNA isolation from total blood</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>miRVana microRNA isolation kit</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM1561</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acid-Phenol: CHCl3</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>9721G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNase 1</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>79254</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4326614</td>
 <td>For TLDA cards</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex RT rodent Pool Set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444746</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex preamp rodent Pool set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444747</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444909</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex RT Human Pool set V3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444745</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex Preamp human pool set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444748</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444913</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman MicroRNA RT kit</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4366596</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman fast universal PCR master mix </td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4366072</td>
 <td>For mRNA qRT-PCR</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tumor necrosis factor (primer probe)</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>Hs01113624_g1 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vascular endothelial growth factor A (primer probe)</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>Hs00900055_m1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>K1642</td>
 <td>For mRNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HSP70 antibody</td>
 <td>Abcam</td>
 <td>ab94368 </td>
 <td>For western blot</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-rabbit IgG-Gold</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G7402</td>
 <td>For electron microscopy</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rabbit-anti CD81</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>SAB3500454</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nickel 300 mesh carbon formvar grids</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>FCF300-Ni</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Copper 300 mesh carbon formvar grids</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>FCF300-Cu</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 1. Table of specific reagents.</td>
</tr>
 </tbody>
 </table>

purification and microrna profiling of exosomes derived from blood and culture media

MiRNA stabili sono presenti in tutti i fluidi corporei e di alcuni microRNA circolanti sono protetti dalla degradazione di sequestro in piccole vescicole chiamate exosomes. Exosomes possono fondersi con la membrana plasmatica con conseguente trasferimento di RNA e proteine ​​per la cellula bersaglio. Le loro funzioni biologiche includono la risposta immunitaria, presentazione dell&#39;antigene, e la comunicazione intracellulare. Consegna dei miRNA che possono regolare l&#39;espressione genica nelle cellule riceventi attraverso il sangue ha aperto nuove strade per l&#39;intervento di destinazione. Oltre ad offrire una strategia per la consegna di farmaci o RNA agenti terapeutici, contenuti exosomal possono servire come biomarcatori che possono aiutare nella diagnosi, determinare le opzioni di trattamento e la prognosi. Qui descriveremo la procedura per analizzare quantitativamente miRNA e RNA messaggero (mRNA) da exosomes secreti nel sangue e nei mezzi di coltura cellulare. Exosomes purificati saranno caratterizzati mediante analisi Western Blot per exosmarcatori Omal e PCR per mRNA di interesse. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e l&#39;etichettatura immunogold verranno utilizzati per convalidare la morfologia e l&#39;integrità exosomal. L&#39;RNA totale saranno purificati da questi exosomes per assicurare che siamo in grado di studiare sia l&#39;mRNA e miRNA dallo stesso campione. Dopo la convalida integrità dell&#39;RNA da Bioanalyzer, eseguiremo una produttività quantitativa real time PCR media (qPCR) per identificare il miRNA exosomal utilizzando Taqman Low Density Array (TLDA) carte e studi di espressione genica per le trascrizioni di interesse. Questi protocolli possono essere usati per quantificare variazioni miRNAs exosomal in pazienti, modelli di roditori e terreni di coltura cellulare prima e dopo l&#39;intervento farmacologico. Contenuto Exosomal variabili per la fonte di origine e le condizioni fisiologiche di cellule che secernono exosomes. Queste variazioni possono fornire informazioni su come le cellule e sistemi di far fronte allo stress o perturbazioni fisiologiche. I nostri dati rappresentativi mostrano variations in miRNA presenti in exosomes purificate dal sangue del mouse, sangue umano e mezzi di coltura di cellule umane. Qui descriveremo la procedura per analizzare quantitativamente miRNA e RNA messaggero (mRNA) da exosomes secreti nel sangue e nei mezzi di coltura cellulare. Exosomes purificati saranno caratterizzati mediante analisi western blot per i marcatori exosomal e PCR per mRNA di interesse. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e l&#39;etichettatura immunogold verranno utilizzati per convalidare la morfologia e l&#39;integrità exosomal. L&#39;RNA totale saranno purificati da questi exosomes per assicurare che siamo in grado di studiare sia l&#39;mRNA e miRNA dallo stesso campione. Dopo la convalida integrità dell&#39;RNA da Bioanalyzer, eseguiremo una produttività quantitativa real time PCR media (qPCR) per identificare il miRNA exosomal utilizzando Taqman Low Density Array (TLDA) carte e studi di espressione genica per le trascrizioni di interesse. Questi protocolli possono essere usati per quantificare variazioni miRNA exosomal in pazienti, modelli di roditori e terreni di coltura delle cellule prima e dopo l&#39;intervento farmacologico. Contenuto Exosomal variabili per la fonte di origine e le condizioni fisiologiche di cellule che secernono exosomes. Queste variazioni possono fornire informazioni su come le cellule e sistemi di far fronte allo stress o perturbazioni fisiologiche. I nostri dati rappresentativi mostrano variazioni di miRNA presenti in exosomes purificate dal sangue del mouse, sangue umano e mezzi di coltura di cellule umane

Dopo aver isolato exosomes da sangue o terreni di coltura cellulare, la purezza dei exosomes può essere testata mediante microscopia elettronica (EM) e western blot (Figure 1A e 1B). Abbiamo confermato la nostra preparazione exosome da varie fonti con EM e western blot utilizzando anticorpi multipli. Figura 1A mostra EM immagini confermando che exosomes sono intatte con un diametro di ~ 30 -100 nm e contengono CD81 mediante l&#39;etichettatura immunogold. Marcatori exo...

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Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

La presenza di microRNA stabili (miRNA) in exosomes ha generato enorme interesse come un romanzo modalità di comunicazione intercellulare, per la loro potenziale utilità come biomarcatori e come via per l&#39;intervento terapeutico. Qui mostriamo purificazione exosome dal sangue e cultura mediatica seguita da PCR quantitativa per identificare miRNA trasportati.

Purificazione e microRNA profiling di Exosomes derivati ​​dal sangue e cultura dei media

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs  are protected from degradation by sequestration in small vesicles called  ...

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