Name: creating adhesive and soluble gradients for imaging cell migration with fluorescence microscopy
Uploaded: 2013-04-04T13:00:00
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Los autores agradecen la financiación del Consejo Australiano de Investigación y Nacional de Salud y Consejo de Investigación Médica de Australia y también agradecer a la Nacional Australiana para la instalación de fabricación de SU-8 maestro para la impresión por microcontacto. SHN con el apoyo del Ministerio de Educación Superior y la Universidad Sains Malasia Malasia.

1. Pasivación de Cubreobjetos de vidrio con PLL-PEG-biotina Este paso está diseñado para neutralizar la superficie para que las células se adhieran y migrar hacia regiones específicas sobre el cubreobjetos de vidrio que se crean con la impresión microcontract (Paso 2-3a) o litografía de inmersión pluma (Step 3b). Para la pasivación, un co-polímero de poli-L-lisina (PLL) y polietilenglicol (PEG) se usa en la que 20% de las moléculas de PEG se injertan a biotina (PLL-PEG-biotina). </p...

<ol>
	<li>Pulsipher, A., Yousaf, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+Chemistry+and+Cell+Biological+Tools+for+the+Analysis+of+Cell+Adhesion+and+Migration.">Surface Chemistry and Cell Biological Tools for the Analysis of Cell Adhesion and Migration.</a> Chem. BioChem. 11, 745-753 (2010).</li><li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoskeleton+and+cancer.">The cytoskeleton and cancer.</a> Cancer Metastasis Reviews. 28, 5-14 (2009).</li><li>Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. 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(22), e1065 (2008).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels.">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nat. Protocols. 7, 1247-1259 (2012).</li><li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscale+patterning.">Soft lithography for micro- and nanoscale patterning.</a> Nat. Protocols. 5, 491-502 (2010).</li><li>Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. 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Mater. 21, 2257-2268 (2009).</li><li>Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+dip-pen+nanolithography.">Applications of dip-pen nanolithography.</a> Nat. Nano. 2, 145-155 (2007).</li><li>Wouters, D., Schubert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanolithography+and+nanochemistry:+probe-related+patterning+techniques+and+chemical+modification+for+nanometer-sized+devices.">Nanolithography and nanochemistry: probe-related patterning techniques and chemical modification for nanometer-sized devices.</a> Angewandte Chemie (International ed. in English). 43, 2480-2495 (2004).</li><li>Xia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+control+of+cell+motility+through+focal+adhesion+positioning+and+spatial+control+of+Rac+activation.">Directional control of cell motility through focal adhesion positioning and spatial control of Rac activation.</a> FASEB J. 22, 1649-1659 (2008).</li><li>Oakes, P. W., Beckham, Y., Stricker, J., Gardel, M. 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En este protocolo, se utiliza un dispositivo de microfluidos disponible comercialmente (pegajoso-Slide 3D ​​quimiotactismo de ibidi) para estudiar los efectos de las superficies modificadas químicamente y gradientes quimiotácticos sobre la migración celular. Esta configuración no requiere microfluídico de flujo porque el gradiente se establece por difusión a lo largo de la longitud del canal. Esto es importante porque el flujo podrían afectar diferencialmente a células que migran lentamente, tales...

La migración dirigida de células es una propiedad fundamental de muchas células y es un aspecto clave de muchos procesos fisiológicos normales, como el desarrollo embrionario, la defensa contra la infección y la cicatrización de heridas. Además, la migración celular también juega un papel importante en muchas enfermedades tales como enfermedad vascular, metástasis de células tumorales y 1,2 inflamación crónica. Mientras que los estados clásicos de la migración celular - polarización, de extensión saliente, formación de adhesión, la generación de la fuerza y la retracción posterior - 3,4 son generalmente aceptados, la elucidación de los mecanismos espaciotemporales por el cual coordina la señal de integración ha sido más difícil. La matriz extracelular (ECM) sirve como sustrato para la adhesión celular, y por medio de química inherente 5 y 6 diversidad física, proporciona indicaciones direccionales para células de navegación 7,8. Además de estas señales de adhesivo 9, factores solubles 10-12 &lt;/ Sup&gt; tales como quimiocinas y factores de crecimiento puede inducir la migración dirigida de células a través de receptores quimioatrayentes y su señalización aguas abajo motogénica. Actualmente, no se sabe si el compromiso y la señalización a través de receptores de adhesión (es decir, integrinas) o receptores quimioatrayentes, tales como receptores tirosina quinasa (RTK), son dominantes. Tampoco se sabe si las jerarquías de sistemas receptores son específicos del tipo celular. Microscopia de células vivas da una gran cantidad de información que no es accesible en ensayos a granel y se pueden combinar con dispositivos de microfluidos para generar gradientes inmovilizados señales de 13,14 y soluble 15 16. El método aquí descrito utiliza una serie de pasos simples y establecidos para la modificación superficial en conjunción con una cámara de microfluidos disponible comercialmente para crear un ensayo de formación de imágenes para la migración celular que se puede implementar fácilmente en un laboratorio de biología celular (Figura 1). El ensambladodispositivo microfluídico tiene cualidades ópticas que sean comparables al vidrio 17 y los gradientes de moléculas difusibles son estables durante al menos 16 h. El sistema puede ser utilizado para las técnicas de microscopía de epifluorescencia y avanzada. A diferencia de otras configuraciones de quimiotaxis de 18, este sistema es adecuado para la grabación lentamente migración, las células adherentes. Es importante destacar que el sistema es modular y permite fácilmente la introducción de adhesivo alternativa o señales solubles migración y el examen de diversos tipos de células.

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coverglass staining outfits</td>
 <td>Thomas Scientific</td>
 <td>8542 E40</td>
 <td>Coverslip rack</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Oven</td>
 <td>Binder</td>
 <td></td>
 <td>ED 53 series</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicon wafer</td>
 <td>Silicon Quest</td>
 <td>708-007</td>
 <td>Boron doped &lt;100&gt; wafer, 4" diameter, 500 &mu;m, single side polished</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GM1070 SU-8 photoresist</td>
 <td>Gersteltec Sarl</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SU-8 developer</td>
 <td>Gersteltec Sarl</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sylgard 184 curing agent</td>
 <td>Dow Corning</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sylgard 184 elastomer prepolymer</td>
 <td>Dow Corning</td>
 <td></td>
 <td >&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PLL-PEG-biotin (20%)</td>
 <td>SuSos AG</td>
 <td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)</td>
 <td>1 mg/ml in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescein</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>46955</td>
 <td>1 mM in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin-AlexaFluor350</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>S-11249</td>
 <td>1 mg/ml in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-4-fluorescein</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>B-1370</td>
 <td>0.03 &mu;g/&mu;l in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-RGD</td>
 <td>GenScript</td>
 <td>SC1208</td>
 <td>0.03 mg/ml in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syto 64 Red</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td> S-11346 </td>
 <td>1 &mu;M in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sticky slide chemotaxis 3D</td>
 <td>Ibidi</td>
 <td>80328</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>200 &mu;l Greiner yellow bevelled tip</td>
 <td>Greiner Bio-One</td>
 <td>739261</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vaseline</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>16415</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraffin wax, mp 55-57 &deg;C</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>327204</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nano eNabler 10 &mu;m cantilever </td>
 <td>BioForce</td>
 <td>SPT-S-C-10s</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Image J software</td>
 <td>National Institute of Health</td>
 <td></td>
 <td ><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manual Tracking plugin</td>
 <td>Fabrice Cordeli&egrave;res</td>
 <td></td>
 <td ><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html" target="_blank">rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chemotaxis and Migration Tool</td>
 <td>Ibidi GmbH</td>
 <td></td>
 <td><a href="http://www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html" target="_blank">www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html</a></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

creating adhesive and soluble gradients for imaging cell migration with fluorescence microscopy

Las células se pueden detectar y migrar hacia mayores concentraciones de señales adhesivas tales como las glicoproteínas de la matriz extracelular y señales solubles tales como factores de crecimiento. Aquí, describimos un método para crear gradientes opuestos de señales adhesivas y soluble en una cámara de microfluidos, que es compatible con imágenes de células vivas. Un copolímero de poli-L-lisina y polietilenglicol (PEG-PLL) se emplea para pasivar cubreobjetos de vidrio y evitar la adsorción no específica de biomoléculas y células. Siguiente impresión, por microcontacto o inmersión litografía pluma se utilizan para crear pistas de estreptavidina en las superficies pasivadas para servir como puntos de anclaje para el péptido biotinilado arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) como la señal adhesivo. Un dispositivo microfluídico se coloca sobre la superficie modificada y utilizada para crear el gradiente de las señales de adhesivo (100% RGD a 0% RGD) en las pistas de estreptavidina. Por último, el dispositivo de microfluidos mismo se utiliza para crear un gradiente de un éxito quimioatrayenteh como suero bovino fetal (FBS), como la señal soluble en la dirección opuesta de la pendiente de las señales adhesivas.

Para entender cómo integrar las señales de células migratorias 25, hemos desarrollado un método para celdas de imagen con microscopía de fluorescencia que migrar en un entorno con gradientes compitiendo adhesivas y soluble (Figura 1). Pistas adhesivas que contenían estreptavidina fluorescente y RGD biotinilado se han creado con pistas impresas por microcontacto y dip litografía pluma (Figura 2). Impresión por microcontacto éxito es indicado por el perfil de la línea...

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Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Un método para el montaje de gradientes adhesivas y soluble en una cámara de microscopía para estudios en vivo de células de migración se describe. El entorno de ingeniería combina superficies antiincrustantes y pistas adhesivas con gradientes de solución y por lo tanto permite determinar la importancia relativa de las señales de orientación.

Creación de degradados adhesivas y soluble para la migración celular con imágenes de microscopía de fluorescencia

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Research

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