Name: stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord
Uploaded: 2013-03-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord at JoVE.com

Wij danken Bakhos A. Tannous, Ph.D., directeur van Vector Ontwikkeling en Productie in de Neuroscience Center van het Massachusetts General Hospital, Charlestown, Massachusetts, voor het verstrekken van ons met de rAAV-EGFP vector, en John Whang voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door subsidies R01 NS050408 (naar JS) van het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke.

De beschreven chirurgische procedure is goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van Columbia University. 1. Voorbereiding van apparatuur en Virus deeltjessuspensie <ol><li> Reinig en desinfecteer de apparatuur, steriliseren van de chirurgische instrumenten en de V notch spikes die zullen worden gebruikt om de wervel L1 op te lossen. </li><li> Trek en schuine glazen pipetten. Wij gebruiken pipetten die een tip diameter van 40 urn en afgeschuind onder een hoek...

<ol>
	<li>Lewandoski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+control+of+gene+expression+in+the+mouse.">Conditional control of gene expression in the mouse.</a> Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).</li><li>Couto, L. B., High, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vector-mediated+RNA+interference.">Viral vector-mediated RNA interference.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li><li>Davidson, B. L., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system.">Viral vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Nature Reviews Neuroscience. 4, 353-364 (2003).</li><li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn.">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 823-836 (2010).</li><li>Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+circuit+tracing+in+vivo+through+Cre-dependent+targeting+and+complementation+of+modified+rabies+virus.">Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21848-21853 (2010).</li><li>Lo, L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cre-dependent,+anterograde+transsynaptic+viral+tracer+for+mapping+output+pathways+of+genetically+marked+neurons.">A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons.</a> Neuron. 72, 938-950 (2011).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function.">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nature Methods. 8, 745-752 (2011).</li><li>Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+sensory+axon+regeneration+in+adult+spinal+cord.">Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord.</a> J. Neurosci. 27, 6068-6078 (2007).</li><li>Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+intraspinal+plasticity+after+spinal+cord+injury+alters+the+severity+of+autonomic+dysreflexia.">Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia.</a> J. Neurosci. 26, 2923-2932 (2006).</li><li>Passini, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS-targeted+gene+therapy+improves+survival+and+motor+function+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy.">CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120, 1253-1264 (2010).</li><li>Lutz, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsymptomatic+restoration+of+SMN+rescues+the+disease+phenotype+in+a+mouse+model+of+severe+spinal+muscular+atrophy.">Postsymptomatic restoration of SMN rescues the disease phenotype in a mouse model of severe spinal muscular atrophy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 3029-3041 (2011).</li><li>Chen, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dsAAV+type+2-mediated+gene+transfer+of+MORS196A-EGFP+into+spinal+cord+as+a+pain+management+paradigm.">dsAAV type 2-mediated gene transfer of MORS196A-EGFP into spinal cord as a pain management paradigm.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20096-20101 (2007).</li><li>South, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+deletion+of+the+NR1+subunit+of+the+NMDA+receptor+in+adult+spinal+cord+dorsal+horn+reduces+NMDA+currents+and+injury-induced+pain.">A conditional deletion of the NR1 subunit of the NMDA receptor in adult spinal cord dorsal horn reduces NMDA currents and injury-induced pain.</a> J. Neurosci. 23, 5031-5040 (2003).</li><li>Tappe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+scaffolding+protein+Homer1a+protects+against+chronic+inflammatory+pain.">Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain.</a> Nat. Med. 12, 677-681 (2006).</li><li>Colle, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+intracerebral+delivery+of+AAV5+vector+encoding+human+ARSA+in+non-human+primate.">Efficient intracerebral delivery of AAV5 vector encoding human ARSA in non-human primate.</a> Human Molecular Genetics. 19, 147-158 (2010).</li><li>Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+Transplantation+of+Mouse+Neural+Stem+Cells+into+the+Spinal+Cords+of+Mice+Infected+with+Neurotropic+Mouse+Hepatitis+Virus.">Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus.</a> J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).</li><li>Snyder, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+adeno-associated+viral+vector+serotypes+for+spinal+cord+and+motor+neuron+gene+delivery.">Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery.</a> Hum. Gene Ther. 22, 1129-1135 (2011).</li><li>Towne, C., Pertin, M., Beggah, A. T., Aebischer, P., Decosterd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+serotype+6+(rAAV2/6)-mediated+gene+transfer+to+nociceptive+neurons+through+different+routes+of+delivery.">Recombinant adeno-associated virus serotype 6 (rAAV2/6)-mediated gene transfer to nociceptive neurons through different routes of delivery.</a> Mol. Pain. 5, 52 (2009).</li><li>Kaplitt, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+gene+expression+and+phenotypic+correction+using+adeno-associated+virus+vectors+in+the+mammalian.">Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian.</a> 8, 148-154 (1994).</li></ol>

Stereotactische injectie vector kan gericht ruggenmerg neuronen voor toepassingen zoals neuronale netwerk mapping op basis transsynaptic virusverspreiding 6,7 of optogenetic dissectie 8, axon begeleiding tijdens regeneratie van letsel 9,10 of gentherapie voor de preventie of behandeling van neurodegeneratie 11, 12. Virale vectoren zijn gebruikt voor genetische manipulatie in het ruggenmerg te bestuderen somatosensorische, motorische en autonome wegen 9,10,13-15. De ...

Geavanceerde technologieën voor voorwaardelijke genmanipulatie in de muis kan veelzijdige benaderingen van de exploratie van synaptische paden en functionele verbindingen in het centrale zenuwstelsel. Transgenen kan worden geregeld door kleine molecule effectoren zoals doxycycline die op een door tetracycline gecontroleerde transactivator, die kunnen worden ontworpen om als een repressor of activator van gentranscriptie, tamoxifen of herkennen van een gemuteerd ligand-bindend domein van de oestrogeen receptor 1 . Onomkeerbare transgene modificatie wordt meestal bereikt door desoxyribonucleïnezuur (DNA) recombinases. Cre (oorzaken recombinatie) en Flp (flippase recombinatie enzym) katalyseren de excisie, inversie of translocatie van DNA-fragmenten die worden geflankeerd door loxP (locus of kruising x over, P1) of Frt (flippase erkenning doel) sites, respectievelijk 1. Toepassingen omvatten genactivering of silencing en induceerbare ribonucleïnezuur (RNA) interferentie <sup&gt; 2. Conditionele expressie van fluorescerende of enzymatische reporters zoals β-galactosidase of alkaline fosfatase kan worden gebruikt om neuronen labelen en onderzoek naar de actuele organisatie en verbinding 3. Grootschalige projecten mutagenese in Noord-Amerika ( <a href="http://www.norcomm.org/index.htm" target="_blank">http://www.norcomm.org/index.htm</a> ) en Europa ( <a href="http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm" target="_blank">http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm</a> ) produceren van bibliotheken van muis embryonale stamcellen klonen met conditionele gen doelen en valkuilen die uiteindelijk de gehele muis genoom. Muizen gegenereerd uit deze klonen kunnen worden gekruist met een toenemend aantal muizenlijnen die uitdrukken DNA recombinases onder promoters of loci specifiek voor een bepaalde populatie neuronen voor selectieve genmanipulatie ( <a href="http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index.php" target="_blank">http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . php</a> ). <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; evenwel beperkt genmanipulatie tot afzonderlijke populaties van neuronen of bepaalde gebieden plaats niet worden bereikt door genetische richten alleen als een promotor specifiek voor de populatie neuron plaats niet bekend is of niet die door alle neuronen in de regio van belang. In het ruggenmerg kan experimenteel ontwerpen vereisen ruimtelijke beperking van de genetische manipulatie een of twee craniocaudale segmenten. Stereotactische injectie van een virale vector die Cre of Flp expressie kan beperken gen recombinatie regio in het ruggenmerg van muizen waarbij DNA-fragmenten worden geflankeerd door loxP of Frt sites, zogenaamde floxed of flrted allelen. In tegenstelling tot de constitutieve DNA herschikking, die zou voortvloeien uit kruisingen van de dieren met recombinase uitdrukken muizen, deze strategie biedt ook tijdelijke controle over gen-activatie of silencing. Virale vectoren die coderen floxed of flirtte transgenen bieden een omgekeerde optie van genetische manipulatie in muizen die het corresponding recombinase stroomafwaarts van een neuron-specifieke promoter. Verschillende recombinante vectoren met affiniteit voor neuronen zijn 4. Hoge capaciteit (laf) adenovirus, adeno-geassocieerd virus, herpes simplex virus en lentivirus worden gebruikt neurotrope vectoren. Het selecteren van de juiste virus voor een onderzoeks-vraag is een cruciaal onderdeel van de experimentele opzet. Grootte van het transgen levering route, specificiteit van de infectie neuronen in tegenstelling tot gliacellen, infectie efficiëntie, ontstekings-en toxische bijwerkingen moeten worden overwogen 4. Hier beschrijven we de stereotaxische injectie van een virale vector in de dorsale hoorn van het ruggenmerg, een techniek die we gebruiken voor voorwaardelijke genregulatie in ons onderzoek naar de neurobiologie van pijn. De dorsale hoorn ontvangt afferente input van primaire somatosensorische neuronen inclusief nociceptieve neuronen. Lokale interneuronen verwerken de informatie voordat projectie neuronen het overbrengen vande dorsale hoorn naar de hersenen 5. We demonstreren de infectie van dorsale hoorn neuronen spinale segmentale niveau L4 met een neurotrope recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) die versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP) tot expressie brengt onder een constitutief actieve promoter cytomegalovirus.

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiaalnaam </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td></td></tr><tr><td> Spinal bodemplaat </td><td> David Kopf Instrumenten </td><td> 912 </td><td></td></tr><tr><td> Klein dier stereotaxische instrument </td><td> David Kopf Instrumenten </td><td> 900 </td><td></td></tr><tr><td> Muis gas narcose hoofd houder </td><td> David Kopf Instrumenten </td><td> 923-B </td><td></td></tr><tr><td> Verstelbare voet mounts </td><td> David Kopf Instrumenten </td><td> 982 </td><td></td></tr><tr><td> V notch spikes </td><td> David Kopf Instrumenten </td><td> 987 </td><td></td></tr><tr><td> Kleine dieren temperatuur controle systeem </td><td> David Kopf Instrumenten </td><td> TCAT-2LV </td><td></td></tr><tr><td> Adson forceps </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.006-12 </td><td></td></tr><tr><td> Laminectomie tang </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.223-20 </td><td></td></tr><tr><td> UltraMicroPump (een) met SYS-Micro4 Controller </td><td> Wereld Precisie-instrumenten </td><td> UMP3-1 </td><td></td></tr><tr><td> Micro-injectiespuit, 65RN </td><td> Hamilton </td><td> 7633 tot 01 </td><td></td></tr><tr><td> RN knelkoppeling, 1 mm </td><td> Hamilton </td><td> 55.750-01 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilicaatglas haarvaten </td><td> Wereld Precisie-instrumenten </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microgrinder </td><td> Narishige </td><td> EG-44 </td><td></td></tr></tbody></table>

stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord

Intraparenchymale injectie van een virale vector kan afhankelijk genmanipulatie in verschillende populaties van neuronen of bepaalde delen van het centrale zenuwstelsel. We tonen een stereotactische injectie techniek gerichte genexpressie of silencing in de dorsale hoorn van het ruggenmerg kan muis. De chirurgische procedure is kort. Het vereist laminectomie van een enkele wervel, die voorziet in een snel herstel van het dier en ongeschonden beweeglijkheid van de wervelkolom. Gecontroleerde injectie van een kleine vector schorsing volume bij lage snelheid en het gebruik van een micro-met afgeschuinde glazen canule minimaliseren het weefsel laesie. De lokale immuunrespons op de vector hangt af van de intrinsieke eigenschappen van de gebruikte virus, in onze ervaring is klein en kort als een recombinant adeno-geassocieerd virus wordt gebruikt. Een reportergen zoals versterkt groen fluorescent eiwit vergemakkelijkt controle ruimtelijke verdeling van de vector en de werkzaamheid en cellulaire specificity van de transfectie.

Succesvolle transfectie levert robuuste genexpressie in neuronen van de geïnjecteerde dorsale hoorn (Figuur 1), sparen de dorsale hoorn van de contralaterale zijde, de ventrale hoorn en de dorsale wortel ganglia. <img src="/files/ftp_upload/50313/50313fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Transfectie van dorsale hoorn neuronen. (A) Expressie van het fluorescerende reporter EGFP (groen) in de linker dorsale hoorn van het ruggenmerg L4, twee weken na ste...

Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord at JoVE.com

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Virale vectoren kunnen gerichte genetische manipulatie. We tonen een werkwijze voor voorwaardelijke genexpressie of ablatie in de muis ruggenmerg, met stereotactische injectie van een virale vector in de dorsale hoorn, een prominente plaats van synaptische contacten tussen primaire somatosensorische afferenten en neuronen van het centrale zenuwstelsel.

Stereotactische injectie van een virale vector voor voorwaardelijke Gene Manipulation in de muis Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Spinal Cord Elektrofysiologie II: Extracellulaire Suction Elektrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo beeldvorming van de muis ruggenmerg met behulp van twee-foton Microscopie

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Uitbreiding van embryonale en adulte neurale stamcellen door<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation of Viral stereotactische injectie

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Intracerebroventriculaire Viral Injectie van de Neonatale Mouse Brain voor persistent en wijdverbreide Neuronale Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Een procedure voor het implanteren van een Spinal Kamer voor Longitudinaal<em&gt; In Vivo</em&gt; Beeldvorming van de Muis Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Twee-foton Imaging van Cellular Dynamics in de Muis Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Stereotaxic chirurgie voor genetische manipulatie van striatale cellen van neonatale muis hersenen

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Implantatie van de laminectomie en het ruggenmerg in de muis

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

Directe inspuiting van een lentivirale Vector hoogtepunten meerdere Motor trajecten in het ruggenmerg Rat

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Intra-arteriële levering van neurale stamcellen aan de Rat en Mouse Brain: Toepassing op cerebrale ischemie

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...