Name: stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord
Uploaded: 2013-03-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord at JoVE.com

Nous remercions Bakhos A. Tannous, Ph.D., directeur du développement et de la production Vector dans la Neuroscience Center du Massachusetts General Hospital, Charlestown, Massachusetts, pour nous avoir fourni le vecteur rAAV-EGFP, et John Whang pour l&#39;assistance technique. Ce travail a été soutenu par une bourse R01 NS050408 (JS) de l&#39;Institut national des troubles neurologiques et des maladies.

La procédure chirurgicale décrite a été approuvé par le soin des animaux et du Comité institutionnel d&#39;utilisation (IACUC) de l&#39;Université de Columbia. 1. Préparation de l&#39;équipement et de la suspension de particules de virus <ol><li> Nettoyer et désinfecter le matériel, stériliser les instruments chirurgicaux et les pointes entaille en V qui seront utilisés pour fixer L1 vertèbre. </li><li> Tirez et pipettes en verre coniques. Nous utilisons des pipettes qui ont ...

<ol>
	<li>Lewandoski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+control+of+gene+expression+in+the+mouse.">Conditional control of gene expression in the mouse.</a> Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).</li><li>Couto, L. B., High, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vector-mediated+RNA+interference.">Viral vector-mediated RNA interference.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li><li>Davidson, B. L., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system.">Viral vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Nature Reviews Neuroscience. 4, 353-364 (2003).</li><li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn.">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 823-836 (2010).</li><li>Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+circuit+tracing+in+vivo+through+Cre-dependent+targeting+and+complementation+of+modified+rabies+virus.">Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21848-21853 (2010).</li><li>Lo, L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cre-dependent,+anterograde+transsynaptic+viral+tracer+for+mapping+output+pathways+of+genetically+marked+neurons.">A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons.</a> Neuron. 72, 938-950 (2011).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function.">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nature Methods. 8, 745-752 (2011).</li><li>Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+sensory+axon+regeneration+in+adult+spinal+cord.">Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord.</a> J. Neurosci. 27, 6068-6078 (2007).</li><li>Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+intraspinal+plasticity+after+spinal+cord+injury+alters+the+severity+of+autonomic+dysreflexia.">Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia.</a> J. Neurosci. 26, 2923-2932 (2006).</li><li>Passini, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS-targeted+gene+therapy+improves+survival+and+motor+function+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy.">CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120, 1253-1264 (2010).</li><li>Lutz, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsymptomatic+restoration+of+SMN+rescues+the+disease+phenotype+in+a+mouse+model+of+severe+spinal+muscular+atrophy.">Postsymptomatic restoration of SMN rescues the disease phenotype in a mouse model of severe spinal muscular atrophy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 3029-3041 (2011).</li><li>Chen, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dsAAV+type+2-mediated+gene+transfer+of+MORS196A-EGFP+into+spinal+cord+as+a+pain+management+paradigm.">dsAAV type 2-mediated gene transfer of MORS196A-EGFP into spinal cord as a pain management paradigm.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20096-20101 (2007).</li><li>South, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+deletion+of+the+NR1+subunit+of+the+NMDA+receptor+in+adult+spinal+cord+dorsal+horn+reduces+NMDA+currents+and+injury-induced+pain.">A conditional deletion of the NR1 subunit of the NMDA receptor in adult spinal cord dorsal horn reduces NMDA currents and injury-induced pain.</a> J. Neurosci. 23, 5031-5040 (2003).</li><li>Tappe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+scaffolding+protein+Homer1a+protects+against+chronic+inflammatory+pain.">Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain.</a> Nat. Med. 12, 677-681 (2006).</li><li>Colle, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+intracerebral+delivery+of+AAV5+vector+encoding+human+ARSA+in+non-human+primate.">Efficient intracerebral delivery of AAV5 vector encoding human ARSA in non-human primate.</a> Human Molecular Genetics. 19, 147-158 (2010).</li><li>Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+Transplantation+of+Mouse+Neural+Stem+Cells+into+the+Spinal+Cords+of+Mice+Infected+with+Neurotropic+Mouse+Hepatitis+Virus.">Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus.</a> J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).</li><li>Snyder, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+adeno-associated+viral+vector+serotypes+for+spinal+cord+and+motor+neuron+gene+delivery.">Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery.</a> Hum. Gene Ther. 22, 1129-1135 (2011).</li><li>Towne, C., Pertin, M., Beggah, A. T., Aebischer, P., Decosterd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+serotype+6+(rAAV2/6)-mediated+gene+transfer+to+nociceptive+neurons+through+different+routes+of+delivery.">Recombinant adeno-associated virus serotype 6 (rAAV2/6)-mediated gene transfer to nociceptive neurons through different routes of delivery.</a> Mol. Pain. 5, 52 (2009).</li><li>Kaplitt, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+gene+expression+and+phenotypic+correction+using+adeno-associated+virus+vectors+in+the+mammalian.">Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian.</a> 8, 148-154 (1994).</li></ol>

Injection stéréotaxique vecteur de ciblage permet neurones de la moelle épinière pour des applications telles que la cartographie du réseau neuronal sur la base de virus d&#39;étalement transsynaptique 6,7 ou 8 optogenetic dissection, guidage axonal pendant la régénération de lésions 9,10, la thérapie génique ou pour la prévention ou le traitement de la neurodégénérescence 11, 12. Les vecteurs viraux ont été utilisés pour la manipulation génétique dans la ...

Les technologies de pointe de la manipulation génétique conditionnelle chez la souris permettent des approches multidimensionnelles à l&#39;exploration des voies synaptiques et les connexions fonctionnelles dans le système nerveux central. Transgènes peut être régulée par petites molécules effectrices telles que la doxycycline agissant sur ​​un transactivateur de tétracycline contrôlée, qui peut être conçu pour fonctionner comme un répresseur ou un activateur de la transcription du gène, ou le tamoxifène reconnaître une mutation de domaine de liaison au ligand du récepteur oestrogène 1 . Modification irréversible transgène est généralement obtenue par l&#39;acide désoxyribonucléique (ADN) recombinases. Cre (recombinaison causes) et Flp (enzyme de recombinaison flippase) catalyser l&#39;excision, inversion ou translocation de fragments d&#39;ADN qui sont flanquées par loxP (lieu de passage sur x, P1) ou Frt (cible de reconnaissance flippase) sites, respectivement 1. Les applications incluent l&#39;activation de gènes ou le silence et l&#39;acide inductible ribonucléique (ARN) des interférences <sup&gt; 2. Expression conditionnelle de reporters fluorescents ou enzymatiques tels que β-galactosidase ou la phosphatase alcaline peut être utilisée pour étiqueter les neurones et d&#39;examiner leur organisation locale et la connectivité 3. Projets de mutagenèse à grande échelle en Amérique du Nord ( <a href="http://www.norcomm.org/index.htm" target="_blank">http://www.norcomm.org/index.htm</a> ) et en Europe ( <a href="http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm" target="_blank">http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm</a> ) produisent des bibliothèques de clones embryonnaires de souris de cellules souches avec gènes cibles conditionnelles et les pièges qui finira par couvrir l&#39;ensemble du génome de la souris. Les souris issues de ces clones peuvent être croisés avec un nombre croissant de lignées de souris qui expriment recombinases ADN dans des promoteurs ou des loci spécifiques à une population particulière de neurones pour la manipulation génétique sélective ( <a href="http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index.php" target="_blank">http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . php</a> ). <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Cependant, restreindre la manipulation génétique de populations distinctes de neurones ou des régions particulières d&#39;intérêt ne peut pas être atteint par ciblage génétique seul si un promoteur spécifique à la population de neurones d&#39;intérêt n&#39;est pas connu ou ne s&#39;exprime pas par tous les neurones de la région d&#39;intérêt. Dans la moelle épinière, des modèles expérimentaux peuvent nécessiter restriction spatiale de la manipulation génétique d&#39;une ou deux segments craniocaudale. Injection stéréotaxique d&#39;un vecteur viral exprimant Cre ou FLP permet de limiter la recombinaison de gènes de régions dans la moelle épinière de souris dans lequel les fragments d&#39;ADN flanqués de sites FRT ou loxP, que l&#39;on appelle allèles floxé ou flrted. Contrairement réarrangement de l&#39;ADN constitutive, qui résulterait de croisements avec des animaux recombinase souris exprimant, cette stratégie permet également de contrôler temporelle sur l&#39;activation de gènes ou le silence. Les vecteurs viraux codant pour floxé ou flirté transgènes offrir une option inverse de la manipulation génétique chez les souris exprimant le corresponding en aval d&#39;un promoteur recombinase spécifique des neurones. Plusieurs vecteurs recombinants ayant une affinité pour les neurones sont disponibles 4. Haute capacité (lâche) adénovirus, virus adéno-associé, l&#39;herpès simplex virus et lentivirus sont couramment utilisés vecteurs neurotropes. Sélection du virus approprié pour une question de recherche est un élément essentiel de la conception expérimentale. Taille du transgène, l&#39;itinéraire de livraison, la spécificité de l&#39;infection des neurones par opposition aux cellules gliales, l&#39;efficacité, l&#39;infection effets secondaires inflammatoires et toxiques doivent être considérées 4. Nous décrivons ici l&#39;injection stéréotaxique d&#39;un vecteur viral dans la corne dorsale de la moelle épinière, une technique que nous employons pour la régulation des gènes avec sursis dans notre recherche sur la neurobiologie de la douleur. La corne dorsale reçoit influx afférents primaires de neurones somatosensoriels y compris les neurones nociceptifs. Interneurones locaux traiter l&#39;information avant de la transmettre neurones de projection dela corne dorsale du cerveau 5. On démontre l&#39;infection des neurones de la corne dorsale de la colonne vertébrale segmentaire niveau L4 avec un neurotrope recombinant virus adéno-associé (rAAV) qui exprime la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) sous un promoteur du cytomégalovirus constitutivement actif.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du produit </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td></td></tr><tr><td> Plaque de base épinière </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 912 </td><td></td></tr><tr><td> Petit instrument stéréotaxique animaux </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 900 </td><td></td></tr><tr><td> Gaz souris de tête anesthésie titulaire </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 923-B </td><td></td></tr><tr><td> Supports de base ajustables </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 982 </td><td></td></tr><tr><td> V notch pointes </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 987 </td><td></td></tr><tr><td> Petit système de contrôle de la température des animaux </td><td> David Kopf Instruments </td><td> TCAT-2LV </td><td></td></tr><tr><td> Adson pince </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11006-12 </td><td></td></tr><tr><td> Pince laminectomie </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11223-20 </td><td></td></tr><tr><td> UltraMicroPump (un) par SYS-MICRO4 contrôleur </td><td> World Precision Instruments </td><td> UMP3-1 </td><td></td></tr><tr><td> Microseringue 65RN </td><td> Hamilton </td><td> 7633-01 </td><td></td></tr><tr><td> Raccord à compression RN, 1 mm </td><td> Hamilton </td><td> 55750-01 </td><td></td></tr><tr><td> Verre borosilicate capillaires </td><td> World Precision Instruments </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microgrinder </td><td> Narishige </td><td> EG-44 </td><td></td></tr></tbody></table>

stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord

Injection intra-parenchymateux d&#39;un vecteur viral permet la manipulation génétique conditionnel populations distinctes de neurones ou des régions particulières du système nerveux central. Nous démontrons une technique d&#39;injection stéréotaxique qui permet l&#39;expression du gène ciblé ou le silence dans la corne dorsale de la moelle épinière de souris. L&#39;intervention chirurgicale est de courte durée. Il nécessite laminectomie d&#39;une vertèbre unique, offrant pour la récupération rapide de l&#39;animal et de la motilité intacte de la colonne vertébrale. Injection contrôlée d&#39;un volume de suspension petit vecteur à faible vitesse et à l&#39;utilisation d&#39;une micro-canule avec verre biseauté minimiser la lésion tissulaire. La réponse immunitaire locale au vecteur dépend des propriétés intrinsèques du virus utilisé, dans notre expérience, il est mineure et de courte durée quand une adéno-associé recombinant virus est utilisé. Un gène rapporteur tel que le renforcement de la protéine fluorescente verte facilite la distribution spatiale de surveillance du vecteur, et l&#39;efficacité et cellulaire spécificité de la transfection.

Rendements de transfection avec succès l&#39;expression des gènes robuste neurones de la corne dorsale injecté (figure 1), épargnant la corne dorsale du côté controlatéral, la corne ventrale et les ganglions de la racine dorsale. <img src="/files/ftp_upload/50313/50313fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. La transfection de neurones de la corne dorsale. (A) Expression de l&#39;EGFP rapporteur fluorescent (vert) dans la corne gauche dorsale de la ...

Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord at JoVE.com

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Les vecteurs viraux permettent une manipulation du gène ciblé. Nous démontrons une méthode pour l&#39;expression génique conditionnelle ou l&#39;ablation de la moelle épinière de souris, par injection stéréotaxique d&#39;un vecteur viral dans la corne dorsale, un important site de contact synaptique entre les afférences somesthésiques primaires et les neurones du système nerveux central.

Injection stéréotaxique d&#39;un vecteur viral pour la manipulation génétique conditionnelle dans la moelle épinière de souris

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

La moelle épinière électrophysiologie II: fabrication des électrodes extracellulaires d&#39;aspiration

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Recherche

Neurosciences

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

Dans l&#39;imagerie in vivo de la moelle épinière de souris utilisant microscopie à deux photons

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion du embryonnaires et cellules souches neurales adultes par<em&gt; In Utero</em&gt; Électroporation ou virale par injection stéréotaxique

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Injection virale intracérébro du cerveau de souris nouveau-né pour la transduction neuronale persistante et généralisée

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Une procédure pour l&#39;implantation d&#39;une chambre pour la colonne vertébrale longitudinale<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie du cordon spinal de souris

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Deux photons Imaging of Cellular Dynamics dans la moelle épinière de souris

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Chirurgie stéréotaxique des manipulations génétiques dans des cellules de cerveaux de souris néonatales striataux

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Laminectomy et implantation de fenêtre de moelle épinière dans la souris

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

Injection directe d’un vecteur Lentiviral met en évidence plusieurs voies motrices de la moelle épinière de Rat

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Livraison intra-artérielle de cellules souches neuronales au cerveau du rat et de la souris : application à l’ischémie cérébrale

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...