Name: stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord
Uploaded: 2013-03-18T13:00:00
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Wir danken Bakhos A. Tannous, Ph.D., Direktor des Vector Entwicklung und Produktion in der Neuroscience Center of Massachusetts General Hospital in Charlestown, Massachusetts, für die Bereitstellung der rAAV-EGFP Vektor, und John Whang für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von grant R01 NS050408 (JS) aus dem National Institute of Neurological Disorders and Stroke unterstützt.

Das chirurgische Verfahren beschrieben wurde vom Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) der Columbia University genehmigt worden. Ein. Vorbereitung der Ausrüstung und Virus-Suspension <ol><li> Reinigen und desinfizieren Sie das Gerät, sterilisieren die chirurgischen Instrumente und die V-Kerbe Spikes, die verwendet werden, um Wirbel L1 beheben werden. </li><li> Ziehen und Kegel Glaspipetten. Wir verwenden Pipetten, die einen Durchmesser der Spitze von 40 um aufweisen und in ...

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Stereotaktische Injektion ermöglicht Targeting-Vektor Rückenmarksneuronen für Anwendungen wie neuronale Netzwerk-Mapping basierend auf transsynaptische Virusverschleppung 6,7 oder optogenetische Dissektion 8, Axon Führung während der Regenerierung vor Verletzungen 9,10 oder Gentherapie zur Prävention oder Behandlung von Neurodegeneration 11, 12. Virale Vektoren sind für Genmanipulation worden im Rückenmark verwendet, um zu untersuchen somatosensorischen, Motor und vege...

Fortgeschrittenen Technologien bedingter Genmanipulation in der Maus zu ermöglichen vielfältige Ansätze zur Exploration von synaptischen Bahnen und funktionelle Verbindungen im zentralen Nervensystem. Transgene können durch niedermolekulare Effektoren wie Doxycyclin Einwirken auf ein Tetracyclin-gesteuerten Transaktivator, die für den Einsatz als Repressor oder Aktivator der Gentranskription, oder Tamoxifen Erkennen eines mutierten Ligandenbindungsdomäne des Östrogenrezeptors 1 funktionieren kann geregelt werden . Irreversible Modifikation Transgen wird üblicherweise von Desoxyribonukleinsäure (DNA) Rekombinasen erreicht. Cre (Ursachen Rekombination) und Flp (Flippase Rekombinationsenzyms) katalysieren die Exzision, Inversion oder Translokation von DNA-Fragmenten, die von loxP (locus der Kreuzung x über, P1) oder Frt (Flippase Anerkennung target) Seiten bzw. 1 flankiert werden. Zu den Anwendungen gehören Gen-Aktivierung oder Inaktivierung und induzierbare Ribonukleinsäure (RNA) Störungen <sup&gt; 2. Bedingungsausdruck von fluoreszierenden oder enzymatischen Reporter wie β-Galactosidase oder alkalischer Phosphatase verwendet werden, um Neuronen beschriften und prüft ihre topische Organisation und Konnektivität 3 werden. Large-scale Mutagenese-Projekte in Nordamerika ( <a href="http://www.norcomm.org/index.htm" target="_blank">http://www.norcomm.org/index.htm</a> ) und Europa ( <a href="http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm" target="_blank">http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm</a> ) produzieren Bibliotheken embryonalen Stammzellen der Maus Zellklone mit bedingten Gen-Targets und Fallen, die letztlich auf das gesamte Maus-Genom. Mäuse aus diesen Klonen erzeugt werden, können mit einer wachsenden Zahl von Maus Linien gekreuzt werden, daß DNA-Rekombinasen exprimieren unter Promotoren oder Loci für eine bestimmte Population von Neuronen zur selektiven Genmanipulation ( <a href="http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index.php" target="_blank">http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . php</a> ). <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Allerdings kann die Beschränkung auf Genmanipulation unterschiedliche Populationen von Neuronen oder bestimmten Regionen von Interesse nicht durch genetische Targeting allein, wenn ein Promotor spezifisch für die Neuronenpopulation von Interesse nicht bekannt ist und nicht von allen Neuronen in der Region exprimiert erreicht werden von Interesse. Im Rückenmark können experimentellen Designs erfordern räumlichen Beschränkung der Genmanipulation ein oder zwei kraniokaudalen Segmente. Stereotaktische Injektion eines viralen Vektors, Cre oder Flp drückt ermöglicht Begrenzen Genrekombination in Regionen im Rückenmark von Mäusen, in denen DNA-Fragmente von loxP-oder FRT-Stellen flankiert sind, so genannte floxed oder flrted Allelen. Anders als konstitutive DNA-Umlagerung, die würde aus Kreuzungen der Tiere mit Rekombinase exprimierenden Mäusen führen, diese Strategie auch zeitliche Kontrolle über Gen-Aktivierung oder Inaktivierung. Virale Vektoren kodieren gefloxten oder geflirtet Transgene bieten eine umgekehrte Möglichkeit Genmanipulation in Mäusen, die corresponding Rekombinase stromabwärts eines Neuron-spezifischen Promotors. Mehrere rekombinante Vektoren mit Affinität zu Neuronen sind 4. Hochleistungs-(gutless) Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus, Herpes simplex-Virus und Lentivirus-Vektoren werden üblicherweise neurotropen verwendet. Die Auswahl des geeigneten Virus für eine Fragestellung ist ein wichtiger Teil des experimentellen Designs. Größe des Transgens, Lieferroute, Spezifität der Infektion mit Neuronen, um Gliazellen, Infektion Wirksamkeit, entzündlichen und toxische Nebenwirkungen müssen berücksichtigt werden 4 entgegengesetzt. Hier beschreiben wir die stereotaktische Injektion eines viralen Vektors in der dorsalen Horn des Rückenmarks, eine Technik, die wir verwenden zur bedingten Genregulation in unserer Forschung über die Neurobiologie von Schmerz. Das Hinterhorn erhält afferenten Input von primären somatosensorischen Neuronen einschließlich nozizeptiven Neuronen. Lokale Interneurone verarbeiten die Informationen vor der Projektion Neuronen vermitteln sie ausdas Hinterhorn des Gehirns 5. Wir demonstrieren die Infektion von Dorsalhorn spinalen Neuronen an Segmentebene L4 mit einem neurotropen rekombinanten Adeno-assoziierten Virus (rAAV), das verstärkt grün fluoreszierende Protein (EGFP) drückt unter einem konstitutiv aktiven CMV-Promotors.

<table border="1"><tbody><tr><td> Material Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td></td></tr><tr><td> Spinal Grundplatte </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 912 </td><td></td></tr><tr><td> Kleintier stereotaktischen Instrument </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 900 </td><td></td></tr><tr><td> Maus Gas Anästhesie Kopfhalter </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 923-B </td><td></td></tr><tr><td> Verstellbare Basis mounts </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 982 </td><td></td></tr><tr><td> V-Kerbe Spikes </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 987 </td><td></td></tr><tr><td> Kleintier-Temperaturregelung </td><td> David Kopf Instruments </td><td> TCAT-2LV </td><td></td></tr><tr><td> Adson Pinzette </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11006-12 </td><td></td></tr><tr><td> Laminektomie Zangen </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11223-20 </td><td></td></tr><tr><td> UltraMicroPump (ein) mit SYS-Micro4-Controller </td><td> World Precision Instruments </td><td> UMP3-1 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroliterspritze, 65RN </td><td> Hamilton </td><td> 7633-01 </td><td></td></tr><tr><td> RN Klemmverschraubung, 1 mm </td><td> Hamilton </td><td> 55750-01 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilikatglas Kapillaren </td><td> World Precision Instruments </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microgrinder </td><td> Narishige </td><td> EG-44 </td><td></td></tr></tbody></table>

stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord

Intraparenchymalen Injektion eines viralen Vektors ermöglicht bedingten Genmanipulation in unterschiedliche Populationen von Neuronen oder bestimmte Bereiche des zentralen Nervensystems. Wir demonstrieren eine stereotaktische Injektion Technik, gezielt Genexpression oder Silencing im dorsalen Horn des Rückenmarks Maus ermöglicht. Der chirurgische Eingriff ist kurz. Es erfordert Laminektomie eines einzelnen Wirbel, bietet für eine schnelle Wiederherstellung des Tieres und ungestörte Beweglichkeit der Wirbelsäule. Kontrollierte Injektion eines kleinen Vektor Suspensionsvolumen bei niedriger Drehzahl und die Verwendung eines Mikrospritze mit abgeschrägten Glaskanüle minimieren Gewebeläsion. Die lokale Immunantwort auf den Vektor, hängt von den spezifischen Eigenschaften des Virus eingesetzt; in unserer Erfahrung ist es kleinen und kurzlebigen wenn ein rekombinantes Adeno-assoziierten Virus verwendet wird. Ein Reportergen wie verstärkt grün fluoreszierende Protein erleichtert die Beobachtung räumliche Verteilung des Vektors oder der Wirksamkeit und zellulären Spezificity der Transfektion.

Erfolgreiche Transfektion ergibt robuste Genexpression in Nervenzellen des eingespritzten Dorsalhorn (Abbildung 1), Schonung der dorsalen Horn von der Gegenseite, Vorderhorn und der Spinalganglien. <img src="/files/ftp_upload/50313/50313fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Transfektion von Hinterhorn-Neuronen. (A) Expression des fluoreszierenden Reporter eGFP (grün) in der linken Hinterhorn des L4 Rückenmark, zwei Wochen nach der stereotaktisch...

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Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Virale Vektoren können für gezielte Genmanipulation. Wir demonstrieren, ein Verfahren zur bedingten Genexpression oder Ablation im Rückenmark der Maus, stereotaktische Injektion unter Verwendung eines viralen Vektors in der dorsalen Horn, ein bekannter Ort der synaptischen Kontakt zwischen primären somatosensorischen Afferenzen und Neuronen des zentralen Nervensystems.

Stereotaktische Injektion eines viralen Vektors für Conditional Gene Manipulation im Maus-Rückenmark

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Spinal Cord Elektrophysiologie II: Extrazelluläre Saugelektrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Forschung

Neurowissenschaften

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In-vivo-Imaging von der Maus Spinal Cord mit Zwei-Photonen-Mikroskopie

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Erweiterung der embryonalen und adulten neuralen Stammzellen<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation oder Viral stereotaktische Injektion

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Intracerebroventricular Viral Injektion der Neonatal Maus Gehirn für anhaltenden und verbreiteten Neuronale Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Ein Verfahren für die Implantation eines Spinal Kammer für Längs<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging der Maus Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Zwei-Photonen-Imaging von Zelluläre Dynamik in der Maus Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Stereotaktischen Chirurgie für Genmanipulation in Striatale Zellen des Neugeborenen Mäusegehirnen

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Laminektomie und Rückenmarksfenster-Implantation in der Maus

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

Direkter Einspritzung von Lentivirale Vektor zeigt mehrere motorische Bahnen im Rückenmark Ratte

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Intra-arterielle Lieferung von neuronalen Stammzellen an das Ratten- und Maushirn: Anwendung auf zerebrale Ischämie

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...