Name: stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord
Uploaded: 2013-03-18T13:00:00
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हम तकनीकी सहायता के लिए ए Bakhos Tannous, पीएच.डी., वेक्टर और मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल, Charlestown, मैसाचुसेट्स, तंत्रिका विज्ञान केन्द्र में विकास और उत्पादन के हमें वेक्टर rAAV EGFP साथ प्रदान करने के लिए निदेशक, और जॉन मारना धन्यवाद. इस काम के लिए अनुदान द्वारा समर्थित किया गया मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक के राष्ट्रीय संस्थान से NS050408 R01 (जे एस).

शल्य वर्णित प्रक्रिया संस्थागत पशु की देखभाल और कोलंबिया विश्वविद्यालय के उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया. 1. उपकरण और वायरस कण निलंबन की तैयारी <ol><li> साफ और कीटाणुरहित उपकरण, सर्जिक...

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	<li>Lewandoski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+control+of+gene+expression+in+the+mouse.">Conditional control of gene expression in the mouse.</a> Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).</li><li>Couto, L. B., High, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vector-mediated+RNA+interference.">Viral vector-mediated RNA interference.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li><li>Davidson, B. L., Breakefield, X. 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9,10 चोट, या जीन थेरेपी से उत्थान के दौरान या 11 neurodegeneration की रोकथाम और उपचार के लिए 6,7 या optogenetic 8 विच्छेदन, अक्षतंतु मार्गदर्शन में फैल transsynaptic वायरस पर आधारित Stereotaxic वेक्टर इंजेक्शन neuronal नेटवर्क मानचि?...

माउस में सशर्त जीन में गड़बड़ी की उन्नत प्रौद्योगिकियों synaptic केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में और रास्ते में कार्यात्मक कनेक्शन के अन्वेषण के लिए बहुमुखी दृष्टिकोण सक्षम. Transgenes डॉक्सीसाइक्लिन जैसे छोटे अणु effectors एक टेट्रासाइक्लिन नियंत्रित transactivator, जो एक repressor या जीन प्रतिलेखन के एक उत्प्रेरक, या tamoxifen एक mutated एस्ट्रोजन एक रिसेप्टर ligand बाध्यकारी डोमेन को पहचानने के रूप में कार्य करने के लिए तैयार किया जा सकता है पर अभिनय द्वारा विनियमित किया जा सकता है . अपरिवर्तनीय transgene संशोधन आमतौर पर deoxyribonucleic एसिड (डीएनए) recombinases द्वारा हासिल की है. (कारणों पुनर्संयोजन) Cre और FLP (flippase पुनर्संयोजन एंजाइम) छांटना उलटा, या डीएनए टुकड़े (पार x बिन्दुपथ के, P1) loxP या Frt (flippase मान्यता लक्ष्य) साइटों, 1 क्रमशः द्वारा flanked हैं स्थानान्तरण उत्प्रेरित. आवेदन जीन सक्रियण या मुंह बंद और inducible ribonucleic एसिड (आरएनए) हस्तक्षेप <sup&gt; 2. Β-galactosidase या alkaline फॉस्फेट के रूप में या एंजाइमी फ्लोरोसेंट पत्रकारों की सशर्त अभिव्यक्ति न्यूरॉन्स लेबल और उनके सामयिक संगठन और 3 कनेक्टिविटी की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उत्तर (अमेरिका में बड़े पैमाने पर mutagenesis परियोजनाओं <a href="http://www.norcomm.org/index.htm" target="_blank">http://www.norcomm.org/index.htm</a> ) और यूरोप ( <a href="http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm" target="_blank">http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm</a> ) माउस भ्रूणीय स्टेम सेल क्लोनों के पुस्तकालयों के साथ उत्पादन कर रहे हैं सशर्त लक्ष्य जीन और जाल है कि अंततः पूरे माउस जीनोम को कवर किया जाएगा. इन क्लोन से उत्पन्न चूहे माउस लाइनों की संख्या एक विस्तार के साथ पार किया जा सकता है कि प्रमोटरों या loci चयनात्मक जीन हेरफेर के लिए न्यूरॉन्स की एक विशेष जनसंख्या (विशिष्ट तहत डीएनए recombinases व्यक्त <a href="http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index.php" target="_blank">http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index php.</a> ). <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; हालांकि, न्यूरॉन्स या ब्याज की विशेष क्षेत्रों की आबादी के लिए अलग हेरफेर जीन सीमित आनुवंशिक अकेले लक्ष्यीकरण अगर एक हित के न्यूरॉन आबादी विशिष्ट प्रमोटर नहीं जाना जाता है या इस क्षेत्र में सभी न्यूरॉन्स द्वारा व्यक्त नहीं किया जा नहीं हासिल हो सकता है ब्याज की. रीढ़ की हड्डी में, प्रयोगात्मक डिजाइन एक या दो craniocaudal क्षेत्रों के लिए जीन में गड़बड़ी की स्थानिक प्रतिबंध की आवश्यकता हो सकती है. एक वायरल वेक्टर कि Cre या FLP व्यक्त करता Stereotaxic इंजेक्शन क्षेत्रों के लिए चूहों में जो डीएनए टुकड़े loxP या Frt साइटों द्वारा flanked हैं की रीढ़ की हड्डी में जीन पुनर्संयोजन सीमित floxed या flrted alleles तथाकथित की अनुमति देता है. विधान डीएनए पुनर्व्यवस्था के विपरीत, जो recombinase व्यक्त चूहों के साथ पशुओं crossbreeding से नतीजा होगा, इस रणनीति भी जीन सक्रियण या मुंह बंद करने पर अस्थायी नियंत्रण प्रदान करता है. वायरल वैक्टर एन्कोडिंग floxed या flirted transgenes चूहों में एक जीन में गड़बड़ी की रिवर्स विकल्प correspo व्यक्त की पेशकशन्यूरॉन विशेष के एक प्रमोटर के recombinase अनुप्रवाह nding. न्यूरॉन्स के लिए आत्मीयता के साथ कई रीकॉम्बीनैंट वैक्टर 4 उपलब्ध हैं. उच्च क्षमता (gutless) adenovirus, एडिनो - जुड़े वायरस, दाद सिंप्लेक्स वायरस और lentivirus सामान्यतः neurotropic वैक्टर किया जाता है. एक शोध प्रश्न के लिए उपयुक्त वायरस का चयन प्रयोगात्मक डिजाइन का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है. Transgene का आकार, प्रसव के मार्ग, संक्रमण के न्यूरॉन्स glial कोशिकाओं, संक्रमण प्रभावकारिता, सूजन और जहरीले साइड इफेक्ट से 4 विचार करने की आवश्यकता के रूप में करने का विरोध करने के लिए विशिष्टता. यहाँ हम रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय सींग, एक तकनीक है कि हम हमारे शोध में दर्द के तंत्रिका जीव विज्ञान पर सशर्त जीन विनियमन के लिए रोजगार में एक वायरल वेक्टर stereotaxic इंजेक्शन का वर्णन. पृष्ठीय सींग nociceptive न्यूरॉन्स सहित प्राथमिक somatosensory न्यूरॉन्स से अभिवाही इनपुट प्राप्त करता है. स्थानीय interneurons जानकारी प्रक्रिया से पहले प्रक्षेपण न्यूरॉन्स से संप्रेषित करने के लिए5 मस्तिष्क पृष्ठीय सींग. हम एक neurotropic पुनः संयोजक एडिनो - जुड़े वायरस (rAAV) कि एक constitutively सक्रिय cytomegalovirus प्रमोटर के तहत बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) व्यक्त के साथ रीढ़ की हड्डी में कमानी L4 स्तर पर पृष्ठीय सींग न्यूरॉन्स के संक्रमण को प्रदर्शित करता है.

<table border="1"><tbody><tr><td> सामग्री का नाम </td><td> कंपनी </td><td> सूचीपत्र संख्या </td><td></td></tr><tr><td> रीढ़ की बेस प्लेट </td><td> डेविड Kopf उपकरण </td><td> 912 </td><td></td></tr><tr><td> छोटे जानवर stereotaxic साधन </td><td> डेविड Kopf उपकरण </td><td> 900 </td><td></td></tr><tr><td> माउस गैस संज्ञाहरण सिर धारक </td><td> डेविड Kopf उपकरण </td><td> 923 - बी </td><td></td></tr><tr><td> समायोज्य आधार mounts </td><td> डेविड Kopf उपकरण </td><td> 982 </td><td></td></tr><tr><td> वी पायदान spikes </td><td> डेविड Kopf उपकरण </td><td> 987 </td><td></td></tr><tr><td> लघु पशु तापमान नियंत्रण प्रणाली </td><td> डेविड Kopf उपकरण </td><td> TCAT - 2LV </td><td></td></tr><tr><td> Adson संदंश </td><td> ललित विज्ञान उपकरण </td><td> 11006-12 </td><td></td></tr><tr><td> Laminectomy संदंश </td><td> ललित विज्ञान उपकरण </td><td> 11223-20 </td><td></td></tr><tr><td> SYS-Micro4 नियंत्रक के साथ UltraMicroPump (एक) </td><td> विश्व प्रेसिजन उपकरण </td><td> UMP3-1 </td><td></td></tr><tr><td> Microsyringe, 65RN </td><td> हैमिलटन </td><td> 7633-01 </td><td></td></tr><tr><td> आर.एन. संपीड़न फिटिंग, 1 मिमी </td><td> हैमिलटन </td><td> 55750-01 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilicate कांच capillaries </td><td> विश्व प्रेसिजन उपकरण </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microgrinder </td><td> Narishige </td><td> ईजी-44 </td><td></td></tr></tbody></table>

stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord

न्यूरॉन्स या केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विशेष क्षेत्रों के अलग आबादियों में एक वायरल वेक्टर Intraparenchymal इंजेक्शन सशर्त हेरफेर जीन में सक्षम बनाता है. हम एक stereotaxic इंजेक्शन तकनीक है कि लक्षित जीन या माउस रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय सींग में अभिव्यक्ति मुंह बंद करने की अनुमति देता है को प्रदर्शित करता है. शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया संक्षिप्त है. यह एक ही बांस की laminectomy, जानवर और रीढ़ की अछूता गतिशीलता के जल्दी ठीक होने के लिए उपलब्ध कराने की आवश्यकता है. कम और beveled कांच प्रवेशनी के साथ एक microsyringe की गति का उपयोग करने पर एक छोटे वेक्टर निलंबन मात्रा नियंत्रित इंजेक्शन ऊतक घाव को कम. स्थानीय वेक्टर के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया नियोजित वायरस के आंतरिक गुणों पर निर्भर करता है, हमारे अनुभव में, यह मामूली और अल्पकालिक है जब एक रीकॉम्बीनैंट एडिनो - जुड़े वायरस का प्रयोग किया जाता है. बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के रूप में इस तरह के एक पत्रकार जीन वेक्टर के स्थानिक वितरण निगरानी की सुविधा है, और प्रभावकारिता और सेलुलर speciअभिकर्मक के ficity.

(1 चित्रा) इंजेक्शन पृष्ठीय सींग के न्यूरॉन्स contralateral ओर, उदर सींग और पृष्ठीय रूट ganglia के पृष्ठीय सींग बख्शते में सफल अभिकर्मक मजबूत जीन की अभिव्यक्ति की पैदावार. <img src="/files/ftp_upload/50313/50313fig1.jpg" alt="चित्र?...

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Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

वायरल वैक्टर लक्षित जीन हेरफेर के लिए अनुमति देते हैं. हम सशर्त जीन की अभिव्यक्ति या माउस रीढ़ की हड्डी में पृथक के लिए एक विधि का प्रदर्शन, पृष्ठीय सींग में एक वायरल वेक्टर stereotaxic इंजेक्शन, प्राथमिक somatosensory afferents और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के न्यूरॉन्स के बीच synaptic संपर्क का एक प्रमुख साइट का उपयोग कर.

माउस स्पाइनल कॉर्ड में सशर्त हेरफेर जीन के लिए एक वायरल वेक्टर की Stereotaxic इंजेक्शन

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

कोशिकी सक्शन इलेक्ट्रोड निर्माण: स्पाइनल कॉर्ड इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी द्वितीय

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

माउस रीढ़ की हड्डी दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग गर्भनाल के vivo इमेजिंग में

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

भ्रूण और वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के द्वारा विस्तार<em&gt; Utero में</em&gt; Electroporation या वायरल Stereotaxic इंजेक्शन

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

लगातार और व्यापक Neuronal पारगमन के लिए नवजात माउस ब्रेन की Intracerebroventricular वायरल इंजेक्शन

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

अनुदैर्ध्य के लिए एक रीढ़ की हड्डी में चैंबर दाखिल के लिए एक प्रक्रिया<em&gt; Vivo</em&gt; माउस स्पाइनल कॉर्ड की इमेजिंग

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

माउस रीढ़ की हड्डी में सेलुलर गतिशीलता के दो photon इमेजिंग

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

नवजात माउस दिमाग के Striatal कोशिकाओं में आनुवंशिक हेरफेर के लिए Stereotaxic सर्जरी

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

माउस में लेमिनेक्टॉमी और स्पाइनल कॉर्ड विंडो प्रत्यारोपण

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

एक मसूर का सीधा इंजेक्शन वेक्टर चूहे रीढ़ की हड्डी में कई मोटर रास्ते पर प्रकाश डाला गया

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

चूहा और माउस मस्तिष्क के लिए तंत्रिका स्टेम सेल की अंतर-धमनी वितरण: सेरेब्रल इस्केमिया के लिए आवेदन

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...