Name: stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord
Uploaded: 2013-03-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord at JoVE.com

Ringraziamo Bakhos A. Tannous, Ph.D., Direttore dello Sviluppo e Produzione vettore nel Centro Neuroscienze del Massachusetts General Hospital, Charlestown, Massachusetts, per averci fornito il rAAV-EGFP vettore, e John Whang per l&#39;assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione R01 NS050408 (JS), presso l&#39;Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo.

La procedura chirurgica descritta è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso (IACUC) della Columbia University. 1. Preparazione delle apparecchiature e delle particelle sospensione di virus <ol><li> Pulire e disinfettare le attrezzature, sterilizzare gli strumenti chirurgici e le punte notch V che verranno utilizzati per fissare vertebra L1. </li><li> Tirare e pipette di vetro conici. Usiamo pipette che hanno un diametro di punta di 40 micron e sono smussa...

<ol>
	<li>Lewandoski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+control+of+gene+expression+in+the+mouse.">Conditional control of gene expression in the mouse.</a> Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).</li><li>Couto, L. B., High, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vector-mediated+RNA+interference.">Viral vector-mediated RNA interference.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li><li>Davidson, B. L., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system.">Viral vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Nature Reviews Neuroscience. 4, 353-364 (2003).</li><li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn.">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 823-836 (2010).</li><li>Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+circuit+tracing+in+vivo+through+Cre-dependent+targeting+and+complementation+of+modified+rabies+virus.">Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21848-21853 (2010).</li><li>Lo, L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cre-dependent,+anterograde+transsynaptic+viral+tracer+for+mapping+output+pathways+of+genetically+marked+neurons.">A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons.</a> Neuron. 72, 938-950 (2011).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function.">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nature Methods. 8, 745-752 (2011).</li><li>Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+sensory+axon+regeneration+in+adult+spinal+cord.">Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord.</a> J. Neurosci. 27, 6068-6078 (2007).</li><li>Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+intraspinal+plasticity+after+spinal+cord+injury+alters+the+severity+of+autonomic+dysreflexia.">Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia.</a> J. Neurosci. 26, 2923-2932 (2006).</li><li>Passini, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS-targeted+gene+therapy+improves+survival+and+motor+function+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy.">CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120, 1253-1264 (2010).</li><li>Lutz, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsymptomatic+restoration+of+SMN+rescues+the+disease+phenotype+in+a+mouse+model+of+severe+spinal+muscular+atrophy.">Postsymptomatic restoration of SMN rescues the disease phenotype in a mouse model of severe spinal muscular atrophy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 3029-3041 (2011).</li><li>Chen, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dsAAV+type+2-mediated+gene+transfer+of+MORS196A-EGFP+into+spinal+cord+as+a+pain+management+paradigm.">dsAAV type 2-mediated gene transfer of MORS196A-EGFP into spinal cord as a pain management paradigm.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20096-20101 (2007).</li><li>South, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+deletion+of+the+NR1+subunit+of+the+NMDA+receptor+in+adult+spinal+cord+dorsal+horn+reduces+NMDA+currents+and+injury-induced+pain.">A conditional deletion of the NR1 subunit of the NMDA receptor in adult spinal cord dorsal horn reduces NMDA currents and injury-induced pain.</a> J. Neurosci. 23, 5031-5040 (2003).</li><li>Tappe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+scaffolding+protein+Homer1a+protects+against+chronic+inflammatory+pain.">Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain.</a> Nat. Med. 12, 677-681 (2006).</li><li>Colle, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+intracerebral+delivery+of+AAV5+vector+encoding+human+ARSA+in+non-human+primate.">Efficient intracerebral delivery of AAV5 vector encoding human ARSA in non-human primate.</a> Human Molecular Genetics. 19, 147-158 (2010).</li><li>Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+Transplantation+of+Mouse+Neural+Stem+Cells+into+the+Spinal+Cords+of+Mice+Infected+with+Neurotropic+Mouse+Hepatitis+Virus.">Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus.</a> J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).</li><li>Snyder, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+adeno-associated+viral+vector+serotypes+for+spinal+cord+and+motor+neuron+gene+delivery.">Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery.</a> Hum. Gene Ther. 22, 1129-1135 (2011).</li><li>Towne, C., Pertin, M., Beggah, A. T., Aebischer, P., Decosterd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+serotype+6+(rAAV2/6)-mediated+gene+transfer+to+nociceptive+neurons+through+different+routes+of+delivery.">Recombinant adeno-associated virus serotype 6 (rAAV2/6)-mediated gene transfer to nociceptive neurons through different routes of delivery.</a> Mol. Pain. 5, 52 (2009).</li><li>Kaplitt, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+gene+expression+and+phenotypic+correction+using+adeno-associated+virus+vectors+in+the+mammalian.">Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian.</a> 8, 148-154 (1994).</li></ol>

Iniezione stereotassica vettore permette il targeting neuroni del midollo spinale per applicazioni come la mappatura della rete neuronale basata sul virus transsynaptic diffondere 6,7 o dissezione optogenetic 8, la guida durante la rigenerazione assonale da lesioni 9,10, o la terapia genica per la prevenzione o il trattamento di neurodegenerazione 11, 12. Vettori virali sono stati utilizzati per la manipolazione del gene nel midollo spinale di studiare somatosensoriali, motori...

Le tecnologie avanzate di manipolazione genica condizionale nel topo consentono molteplici approcci per l&#39;esplorazione di sinapsi e collegamenti funzionali del sistema nervoso centrale. Transgeni può essere regolata da piccole molecole come effettori doxiciclina agenti su un transattivatore della tetraciclina controllato, che può essere progettato per funzionare come un repressore o un attivatore della trascrizione genica, o tamoxifene riconoscere un mutato ligando dominio di legame del recettore di estrogeno 1 . Modifica irreversibile transgene è comunemente ottenuto da acido desossiribonucleico (DNA) ricombinasi. Cre (ricombinazione cause) e Flp (enzima ricombinazione flippase) catalizzare l&#39;, inversione escissione o la traslocazione di frammenti di DNA che vengono affiancati da loxP (luogo di x crossing over, P1) o Frt (target riconoscimento flippase) siti, rispettivamente, 1. Le applicazioni includono l&#39;attivazione del gene o silenziamento inducibile e acido ribonucleico (RNA) ingerenza <sup&gt; 2. Espressione condizionale reporter fluorescente o enzimatica come β-galattosidasi o fosfatasi alcalina può essere usato per etichettare neuroni ed esaminare la loro organizzazione topica e connettività 3. Grandi progetti di mutagenesi in Nord America ( <a href="http://www.norcomm.org/index.htm" target="_blank">http://www.norcomm.org/index.htm</a> ) e in Europa ( <a href="http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm" target="_blank">http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm</a> ) producono librerie di cloni di cellule staminali embrionali di topo con obiettivi gene condizionali e le trappole che alla fine coprono l&#39;intero genoma del mouse. Topi generati da questi cloni possono essere attraversata con un numero crescente di topi che esprimono ricombinasi DNA sotto promotori o loci specifici per una particolare popolazione di neuroni di manipolazione genica selettiva ( <a href="http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index.php" target="_blank">http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . php</a> ). <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Tuttavia, limitando la manipolazione genetica di popolazioni distinte di neuroni o regioni particolari di interesse non può essere ottenuto genetica mira solo se un promotore specifico per la popolazione neurone di interesse non è noto o non espresso da tutti i neuroni della regione di interesse. Nel midollo spinale, disegni sperimentali possono richiedere restrizione spaziale della manipolazione genetica di uno o due segmenti cranio-caudale. Iniezione stereotassica di un vettore virale che esprime Cre o Flp consente di limitare ricombinazione genica per regioni nel midollo spinale di topi in cui si affiancano frammenti di DNA da loxP o siti FRT, cosiddetti alleli floxed o flrted. A differenza di riarrangiamenti del DNA costitutivo, con la conseguenza di incroci animali con topi che esprimono ricombinasi, questa strategia consente anche il controllo temporale su attivazione genica o silenziamento. Vettori virali codificanti floxed o flirtato transgeni offre un&#39;opzione di inversione di manipolazione del gene nei topi esprimere la corresponding valle ricombinasi di un neurone-specifica promotore. Diversi vettori ricombinanti con affinità per i neuroni sono disponibili 4. Alta capacità (gutless) adenovirus, virus adeno-associati, virus dell&#39;herpes simplex e lentivirus sono comunemente utilizzati vettori neurotropici. Selezione del virus appropriato per una domanda di ricerca è una parte cruciale del disegno sperimentale. Dimensione del transgene, percorso di consegna, specificità dell&#39;infezione di neuroni a differenza di cellule gliali, efficacia infezione, effetti collaterali tossici infiammatori e devono essere considerati 4. Qui descriviamo l&#39;iniezione stereotassica di un vettore virale nel corno dorsale del midollo spinale, una tecnica che usiamo per la regolazione genica condizionale nella nostra ricerca sulla neurobiologia del dolore. Il corno dorsale riceve l&#39;input afferente da primari neuroni somatosensoriali inclusi i neuroni nocicettivi. Interneuroni locali elaborare le informazioni prima di neuroni di proiezione che trasmettono dail corno dorsale al cervello 5. Dimostriamo l&#39;infezione di neuroni del corno dorsale a livello segmentale spinale L4 con neurotropico ricombinante virus adeno-associato (rAAV) che esprime migliorato proteina fluorescente verde (EGFP) sotto un promotore di citomegalovirus costitutivamente attivo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td></td></tr><tr><td> Piastra di base della colonna vertebrale </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 912 </td><td></td></tr><tr><td> Piccolo animale strumento stereotassico </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 900 </td><td></td></tr><tr><td> Mouse gas anestesia testa porta </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 923-B </td><td></td></tr><tr><td> Supporti di base regolabili </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 982 </td><td></td></tr><tr><td> V notch picchi </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 987 </td><td></td></tr><tr><td> Piccolo animale temperatura del sistema di controllo </td><td> David Kopf Instruments </td><td> TCAT-2LV </td><td></td></tr><tr><td> Adson forcipe </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11006-12 </td><td></td></tr><tr><td> Laminectomia pinza </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11223-20 </td><td></td></tr><tr><td> UltraMicroPump (uno) con SYS-Micro4 controller </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> UMP3-1 </td><td></td></tr><tr><td> Microsiringa, 65RN </td><td> Hamilton </td><td> 7633-01 </td><td></td></tr><tr><td> RN raccordo a compressione, 1 mm </td><td> Hamilton </td><td> 55750-01 </td><td></td></tr><tr><td> Vetro borosilicato capillari </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microgrinder </td><td> Narishige </td><td> EG-44 </td><td></td></tr></tbody></table>

stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord

Iniezione intraparenchimale di un vettore virale consente la manipolazione condizionale gene in distinte popolazioni di neuroni o regioni specifiche del sistema nervoso centrale. Dimostriamo una tecnica stereotassica iniezione che permette l&#39;espressione del gene bersaglio o silenziamento nel corno dorsale del midollo spinale del mouse. La procedura chirurgica è breve. Richiede laminectomia di una singola vertebra, che prevede il recupero rapido dell&#39;animale e motilità perfetta della colonna vertebrale. Iniezione controllata di un piccolo volume di sospensione vettore a bassa velocità e l&#39;uso di una cannula microsiringa con vetro smussato minimizzare la lesione tissutale. La risposta immunitaria locale al vettore dipende dalle proprietà intrinseche del virus impiegati, nella nostra esperienza, è minore e di breve durata, quando un ricombinante adeno-associated virus viene utilizzato. Un gene reporter come migliore proteina fluorescente verde facilita distribuzione spaziale monitoraggio del vettore, e l&#39;efficacia e cellulare specificity della trasfezione.

Rendimenti di trasfezione di successo l&#39;espressione genica robusta nei neuroni del corno dorsale iniettato (Figura 1), risparmiando il corno dorsale del lato controlaterale, il corno ventrale e gangli delle radici dorsali. <img src="/files/ftp_upload/50313/50313fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. La trasfezione di neuroni del corno dorsale. (A) Espressione della EGFP reporter fluorescente (verde) nel corno sinistro dorsale del midollo spinale L4, ...

Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord at JoVE.com

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Vettori virali per consentire la manipolazione genica mirata. Abbiamo dimostrato un metodo per l&#39;espressione genica condizionale o ablazione nel midollo spinale topo, utilizzando iniezione stereotassica di un vettore virale nel corno dorsale, un luogo di rilievo di contatto sinaptico tra afferenze somatosensoriali primarie e neuroni del sistema nervoso centrale.

Iniezione stereotassica di un vettore virale per la manipolazione del gene condizionale nel midollo spinale del mouse

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Spinal Cord Elettrofisiologia II: extracellulare fabbricazione di elettrodi di aspirazione

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Ricerca

Neuroscienze

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

Imaging in vivo del midollo spinale di topo Utilizzo di due fotoni Microscopia

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Ampliamento della embrionali e cellule staminali neurali adulte per<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione o Viral iniezione stereotassica

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Intracerebroventricular Iniezione virale del cervello neonatale mouse per persistente e diffusa trasduzione neuronale

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Una procedura di impianto del Camera spinale per longitudinale<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging del cavo del mouse spinale

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Due fotoni Imaging di Cellular Dynamics nel midollo spinale del mouse

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Chirurgia stereotassica per la manipolazione genetica in cellule striatali di cervelli di topo neonatale

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Laminectomia e impianto della finestra del cavo spinale nel mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

Iniezione diretta di un vettore lentivirale evidenzia più vie motorie del midollo spinale del ratto

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Consegna intra-arteriosa di cellule staminali neurali al cervello di ratto e topo: applicazione all'ischemia cerebrale

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...