Name: stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord
Uploaded: 2013-03-18T13:00:00
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我々は、技術的な支援をBakhos A. Tannous、博士のrAAV-EGFPベクターを用いて私たちを提供するためのマサチューセッツ総合病院、チャールスタウン、マサチューセッツ州の神経科学センターのベクター開発·生産担当ディレクター、ジョン·むちで打つことに感謝します。この作品は、神経疾患や脳卒中の国立研究所からの助成金によってR01 NS050408を（JS）にサポートされていました。

記載外科手術はコロンビア大学の施設内動物のケアと使用委員会（IACUC）によって承認されています。 1。機器およびウイルス粒子懸濁液の調製<ol><li>装置を清掃し、消毒、手術器具と椎骨L1を固定するために使用されるVノッチスパイクを滅菌します。 </li><li>プルとベベルガラスピペット。我々は、40μmの先端径を持ち、20°の角度で傾斜がついていピペットを使用して?...

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	<li>Lewandoski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+control+of+gene+expression+in+the+mouse.">Conditional control of gene expression in the mouse.</a> Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).</li><li>Couto, L. B., High, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vector-mediated+RNA+interference.">Viral vector-mediated RNA interference.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li><li>Davidson, B. L., Breakefield, X. 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定位ベクターの注入は、神経変性11の予防または治療のために傷害9,10、または遺伝子治療から再生中に6,7またはoptogenetic郭清8、軸索ガイダンスを広げる経シナプスウイルスに基づいて、このような神経ネットワークのマッピングなどのアプリケーションに脊髄ニューロンを標的にできます12。ウイルスベクターは、体性感覚、運動と自律神経?...

マウスにおける条件遺伝子操作の高度な技術は、中枢神経系におけるシナプス経路と機能の接続の探査への多面的なアプローチを可能にします。導入遺伝子は、エストロゲン受容体1の変異型リガンド結合ドメインを認識するリプレッサーまたは遺伝子の転写活性化因子、またはタモキシフェンとして機能するように設計することができるテトラサイクリン制御トランスに作用するようドキシサイクリンなどの小分子エフェクターによって調節することができる。不可逆的な導入遺伝子の改変は、一般的デオキシリボ核酸（DNA）リコンビナーゼによって達成される。 CRE（原因組換え）とFLP（フリッパーゼ組換え酵素）が切除、反転またはそれぞれ1のloxP（クロスxの軌跡上、P1）またはFRT（フリッパーゼ認識対象）サイトが隣接してDNA断片の転移を触媒する。アプリケーションでは、遺伝子の活性化またはサイレンシングおよび誘導リボ核酸（RNA）干渉を含む<sup&gt; 2。例えば、β-ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの蛍光または酵素レポーターの条件式は、ニューロンにラベルを付け、それらの局所組織と接続3を調べるために使用することができます。北米（の大規模な変異導入プロジェクト<a href="http://www.norcomm.org/index.htm" target="_blank">http://www.norcomm.org/index.htm</a> ）、ヨーロッパ（ <a href="http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm" target="_blank">http://www.knockoutmouse.org/about/eucommは</a> ）で、マウス胚性幹細胞クローンのライブラリーを製造しています最終的には全体のマウスゲノムをカバーする条件付き遺伝子標的とトラップ。これらのクローンから生成されたマウスは、選択的な遺伝子操作（たとえば、ニューロンの特定の集団へ特異的プロモーターまたは遺伝子座の下でのDNAリコンビナーゼを発現するマウス系統の拡大数と交配することができる<a href="http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index.php" target="_blank">http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index 。PHP</a> ）。 <p class= &quot;jove_content&quot;&gt;興味のあるニューロン集団に特異的なプロモーターが知られていないか、領域内のすべてのニューロンによって表現されていない場合には、神経細胞や関心のある特定の領域の異なる集団に遺伝子操作を制限することは、単独で標的遺伝子によって達成されない場合があります興味のある。脊髄では、実験的なデザインは、1つまたは2つの頭尾方向のセグメントへの遺伝子操作の空間的制約が必要な場合があります。 CreまたはFLPを発現するウイルスベクターの定位注入フロックス化またはflrted対立、いわゆるDNA断片がloxPまたはFRT部位に隣接されているマウスの脊髄の領域に遺伝子組換えを制限することができます。マウスを表現リコンビナーゼで動物を交配に起因する構成的DNA再構成とは異なり、この戦略はまた、遺伝子の活性化やサイレン以上時間的な制御を提供します。コー​​ドするウイルスベクターは、フロックス化または導入遺伝子はcorrespoを発現するマウスで遺伝子操作の逆のオプションを提供しています浮気ニューロン特異的プロモーターの下流にリコンビナーゼをnding。ニューロンへの親和性を持ついくつかの組換えベクターは、4利用可能です。大容量（ガット）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルスやレンチウイルスは、一般的に神経親和性のベクトルを使用されています。研究課題に適したウイルスを選択すると、実験デザインの重要な部分です。導入遺伝子のサイズ、配送ルート、グリア細胞とは対照的に、神経細胞への感染の特異性、感染症の効能は、炎症性および毒性の副作用が4を考慮する必要があります。 ここでは、脊髄後角へのウイルスベクターを、私たちは痛みの神経生物学上の我々の研究での条件付き遺伝子調節のために採用している手法の定位注射について説明します。後角には侵害受容性ニューロンを含む一次体性感覚ニューロンからの求心性入力を受け取る。投射ニューロンからそれを伝える前に、ローカルの介在ニューロンは情報を処理する脳5〜背角。我々は、構成的に活性サイトメガロウイルスプロモーター下に強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）を発現する神経向性組換えアデノ随伴ウイルス（rAAVの）と脊髄分節レベルL4で後角ニューロンの感染を示しています。

<table border="1"><tbody><tr><td> 材料名 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td></td></tr><tr><td>脊髄ベースプレート</td><td>デビッドKopfはインスツルメンツ</td><td> 912 </td><td></td></tr><tr><td>小動物の定位器</td><td>デビッドKopfはインスツルメンツ</td><td> 900 </td><td></td></tr><tr><td>マウスガス麻酔ヘッドホルダー</td><td>デビッドKopfはインスツルメンツ</td><td> 923-B </td><td></td></tr><tr><td>調整可能なベース·マウント</td><td>デビッドKopfはインスツルメンツ</td><td> 982 </td><td></td></tr><tr><td> Vノッチスパイク</td><td>デビッドKopfはインスツルメンツ</td><td> 987 </td><td></td></tr><tr><td>小動物温度制御システム</td><td>デビッドKopfはインスツルメンツ</td><td> TCAT-2LV </td><td></td></tr><tr><td>アドソン鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11006から12 </td><td></td></tr><tr><td>椎弓切除鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11223から20 </td><td></td></tr><tr><td> SYS-Micro4コントローラとUltraMicroPump（1） </td><td>ワールド·精密機器</td><td> UMP3-1 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロシリンジ、65RN </td><td>ハミルトン</td><td> 7633から01 </td><td></td></tr><tr><td> RNコンプレッションフィッティング、1ミリメートル</td><td>ハミルトン</td><td> 55750から01 </td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスキャピラリー</td><td>ワールド·精密機器</td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microgrinder </td><td>ナリシゲ</td><td> EG-44 </td><td></td></tr></tbody></table>

stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord

ウイルスベクターの実質内注射は、神経細胞や中枢神経系の特定領域の異なる集団の中の条件遺伝子操作を可能にします。我々は、マウスの脊髄後角における標的遺伝子発現またはサイレンシングを可能に定位注入技術を実証する。手術は短時間です。それは動物と脊椎の健常運動性の迅速なリカバリを提供する、単一の椎骨の椎弓切除術を必要とします。傾斜のガラスカニューレとシリンジの低速および使用に小さなベクター懸濁液量の制御された注射は組織病変を最小限に抑えます。ベクトルの局所免疫応答は、採用ウイルス固有の性質に依存し、我々の経験では、組換えアデノ随伴ウイルスを使用した場合、マイナーと短命です。このような強化された緑色蛍光タンパク質などのレポーター遺伝子は、ベクターの監視空間分布を容易にし、有効性や携帯仕様トランスフェクションのficity。

反対側、腹角および後根神経節の背角を温存注入後角（ 図1）の神経細胞で成功したトランスフェクションの利回り堅牢な遺伝子発現を、。 <img src="/files/ftp_upload/50313/50313fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。後角ニューロンのトランスフェクション。L4脊髄の左後角における蛍光レポーターEGFP（緑色）の（）式は、2週間のrAAV-EGFPの定位注入後?...

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Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

ウイルスベクターは、標的遺伝子操作が可能になります。我々は、脊髄後角へのウイルスベクターの定位注射、一次体性感覚求心性および中枢神経系の神経細胞間のシナプスの接触の著名なサイトを使って、条件付き遺伝子発現やマウス脊髄におけるアブレーションのための方法を示しています。

マウス脊髄における条件遺伝子操作のためのウイルスベクターの定位注射

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

脊髄電気生理学II：細胞外吸引電極の作製

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

神経科学

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

によって胚および成体神経幹細胞の拡大<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーションまたはウイルス定位注射

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

永続かつ広範な神経伝達のための新生児マウス脳の脳室内ウイルス注射

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

縦断のために脊髄商工を移植するための手順<em&gt;インビボ</emマウス脊髄の&gt;イメージング

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

マウス脊髄における細胞ダイナミクスの二光子イメージング

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

新生児マウス脳の線条体細胞の遺伝的操作の定位手術

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

マウスにおける線込みおよび脊髄窓移植

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

レンチ ウイルスのベクトルの直噴ハイライト ラット脊髄における複数の運動経路

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

ラットおよびマウス脳への神経幹細胞の動脈内デリバリー:脳虚血への応用

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...