Name: stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord
Uploaded: 2013-03-18T13:00:00
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Agradecemos Bakhos A. Tannous, Ph.D., Diretor de Desenvolvimento de Vector e Produção no Centro de Neurociências de Massachusetts General Hospital, em Charlestown, Massachusetts, para fornecer-nos com o vetor rAAV-EGFP e João Whang para assistência técnica. Este trabalho foi financiado por subvenções R01 NS050408 (a JS) do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame.

O procedimento cirúrgico descrito foi aprovado pelo Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC) da Universidade de Columbia. 1. Preparação de Equipamentos e suspensão de partículas de vírus <ol><li> Limpar e desinfectar o equipamento, esterilizar os instrumentos cirúrgicos e os picos de entalhe em V que serão utilizados para fixar vértebra L1. </li><li> Puxe e pipetas de vidro bisel. Usamos pipetas que têm um diâmetro da ponta de 40 um e são chanfrados num ângulo de 20 ...

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	<li>Lewandoski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+control+of+gene+expression+in+the+mouse.">Conditional control of gene expression in the mouse.</a> Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).</li><li>Couto, L. B., High, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vector-mediated+RNA+interference.">Viral vector-mediated RNA interference.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li><li>Davidson, B. L., Breakefield, X. 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Injecção estereotáxica vector permite a segmentação neurónios da espinal medula de aplicações, tais como mapeamento de rede neuronal com base em vírus transsináptica espalhando 6,7 ou optogenética dissecção 8, durante a regeneração axonal de orientação a partir de 9,10 lesão, ou terapia de gene para a prevenção ou tratamento da neurodegeneração 11, 12. Os vectores virais têm sido utilizados para a manipulação de genes na medula espinhal de estudar vias...

As tecnologias avançadas de manipulação genética condicional no rato permitir abordagens multifacetadas para a exploração de vias sinápticas e ligações funcionais no sistema nervoso central. Os transgenes podem ser regulados por moléculas pequenas efectoras, tais como a doxiciclina que actuam sobre um transactivador controlado por tetraciclina, que pode ser concebido para funcionar como um repressor ou um activador da transcrição de genes, ou tamoxifeno reconhecendo um domínio mutado de ligação ao ligando do receptor de estrogénio 1 . Modificação irreversível transgene geralmente é conseguido por o ácido desoxirribonucléico (DNA) recombinases. Cre (recombinação causas) e FLP (flippase enzima de recombinação) catalisam a excisão, inversão ou translocação de fragmentos de DNA que são ladeadas por loxP (locus de cruzamento x mais, P1) ou Frt (flippase alvo de reconhecimento) sites, respectivamente 1. As aplicações incluem a ativação do gene ou silenciamento e ácido induzível ribonucléico (RNA) interferência <sup&gt; 2. Expressão condicional de repórteres fluorescentes ou enzimáticos, tais como β-galactosidase ou fosfatase alcalina pode ser utilizada para rotular os neurónios e examinar a sua organização tópica e conectividade 3. Grandes projectos de mutagênese na América do Norte ( <a href="http://www.norcomm.org/index.htm" target="_blank">http://www.norcomm.org/index.htm</a> ) e Europa ( <a href="http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm" target="_blank">http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm</a> ) estão produzindo bibliotecas de clones de rato com células-tronco embrionárias condicionais genes alvos e armadilhas que eventualmente cobrem o genoma do rato inteiro. Ratos gerados a partir destes clones podem ser cruzadas com um número crescente de linhas de ratinhos que expressam ADN sob recombinases promotores ou loci específicos para uma determinada população de neurónios para a manipulação de genes selectiva ( <a href="http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index.php" target="_blank">http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . php</a> ). <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; No entanto, restringir a manipulação de genes a diferentes populações de neurónios ou de regiões de interesse particular não pode ser obtida por segmentação genética sozinho, se um promotor específico para a população de neurónios de interesse não é conhecido ou não expresso por todos os neurónios na região de interesse. Na medula espinal, os desenhos experimentais podem exigir restrição espacial da manipulação genética de um ou dois segmentos crânio-caudal. Injecção estereotáxica de um vector viral que expressa Cre ou Flp permite limitar a recombinação de genes para as regiões na medula espinal de ratos em que os fragmentos de DNA são flanqueados por sítios loxP ou FRT, os chamados alelos floxed ou flrted. Ao contrário de rearranjo do DNA constituinte, que resultaria da hibridização, os animais com ratos que expressam recombinase, esta estratégia também proporciona um controlo temporal sobre a activação do gene ou silenciamento. Os vectores virais que codificam floxed ou flertou transgenes oferecem uma opção inversa de manipulação de genes em ratos expressando a corresponding recombinase jusante de um promotor específico para neurónios. Vários vetores recombinantes com afinidade para os neurônios estão disponíveis 4. De elevada capacidade de adenovírus (gutless), vírus adeno-associados, vírus do herpes simplex e lentivírus são comumente utilizados vectores neurotrópicas. Selecionando o vírus apropriado para uma questão de pesquisa é uma parte crucial do projeto experimental. Tamanho do transgene, via de administração, a especificidade da infecção para os neurónios, em oposição às células da glia, a eficácia da infecção, os efeitos secundários inflamatórios e tóxicos precisam ser considerados 4. Aqui descrevemos a injecção estereotáxica de um vector viral no corno dorsal da medula espinhal, uma técnica que empregam para a regulação do gene condicional na nossa pesquisa sobre a neurobiologia da dor. O corno dorsal recebe entrada aferente primário neurônios somatossensoriais incluindo neurónios nociceptivos. Interneurônios locais processar as informações antes de neurônios de projeção transmiti-lo a partir decorno dorsal para o cérebro 5. Nós demonstramos que a infecção de neurónios do corno dorsal da coluna vertebral ao nível segmental L4 com um neurotrópica de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) que expressa a proteína verde fluorescente melhorada (EGFP) no âmbito de um promotor de citomegalovírus constitucionalmente activo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome de material </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td></td></tr><tr><td> Placa de base da coluna vertebral </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 912 </td><td></td></tr><tr><td> Instrumento estereotáxico de pequenos animais </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 900 </td><td></td></tr><tr><td> Rato gás suporte da cabeça anestesia </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 923-B </td><td></td></tr><tr><td> Ajustáveis ​​montagens de base </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 982 </td><td></td></tr><tr><td> Picos de entalhe em V </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 987 </td><td></td></tr><tr><td> Pequeno animal, sistema de controlo de temperatura </td><td> David Kopf Instruments </td><td> TCAT-2LV </td><td></td></tr><tr><td> Adson fórceps </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11006-12 </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps laminectomia </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11223-20 </td><td></td></tr><tr><td> UltraMicroPump (um) com SYS-Micro4 Controlador </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td> UMP3-1 </td><td></td></tr><tr><td> Micro-65RN </td><td> Hamilton </td><td> 7633-01 </td><td></td></tr><tr><td> RN de compressão apropriado, 1 mm </td><td> Hamilton </td><td> 55750-01 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilicato capilares de vidro </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microgrinder </td><td> Narishige </td><td> EG-44 </td><td></td></tr></tbody></table>

stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord

Intraparenquimatosa injecção de um vector viral permite a manipulação genética condicional em populações distintas de neurônios ou regiões específicas do sistema nervoso central. Nós demonstramos uma técnica de injecção estereotáxica que permite a expressão do gene alvo ou silenciamento no corno dorsal da medula espinal do rato. O procedimento cirúrgico é breve. Ele requer laminectomia de uma única vértebra, fornecendo para a recuperação rápida do animal e da motilidade perfeita da coluna vertebral. Injecção controlada de um pequeno volume vector suspensão a baixa velocidade e à utilização de uma micro-seringa com cânula de vidro biselado minimizar a lesão dos tecidos. A resposta imunitária local do vector depende das propriedades intrínsecas do vírus empregue, na nossa experiência, é menor e de curta duração quando um vírus adeno-associado recombinante é utilizado. Um gene repórter, tais como a proteína fluorescente verde melhorada facilita a distribuição espacial de controlo do vector, e a eficácia e celular specipecificidade da transfecção.

Sucesso rendimentos de transfecção expressão gênica robusto em neurônios do corno dorsal injetado (Figura 1), poupando o corno dorsal do lado contralateral, o corno anterior e gânglios da raiz dorsal. <img src="/files/ftp_upload/50313/50313fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Transfecção dos neurónios do corno dorsal. (A) Expressão do EGFP repórter fluorescente (verde) no corno dorsal esquerda da medula espinhal L4, duas semanas após a inje...

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Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Vetores virais permitem a manipulação de genes alvo. Nós demonstramos um método para a expressão de genes condicionais ou ablação da medula espinhal de rato, utilizando a injecção estereotáxica de um vector viral no corno dorsal, um local proeminente de contacto sináptico entre os aferentes primários e os neurónios de somatossensorial no sistema nervoso central.

Injeção estereotáxica de um vetor viral para manipulação genética condicional no Cabo de Rato Spinal

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Spinal Cord Eletrofisiologia II: Fabricação Eletrodo de Sucção Extracelular

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Neurociência

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

Em Imaging vivo do Cordão do rato Spinal Usando Two-photon Microscopia

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansão da embrionárias e adultas células-tronco neurais por<em&gt; In Utero</em&gt; Eletroporação ou injeção estereotáxica Viral

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Injection Viral intracerebroventricular do Neonatal do rato do cérebro para a transdução neuronal persistente e generalizada

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Um Processo de Implantação de uma Câmara Spinal para Longitudinal<em&gt; In Vivo</em&gt; Criação de Imagens do Cordão do rato Spinal

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Dois fótons de imagem da Cellular Dynamics na Medula Espinhal Rato

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Cirurgia estereotáxica para manipulação genética em células estriadas de cérebro de rato Neonatal

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Implante de janela de laminectomia e medula espinhal no mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

Injeção direta de um vetor de Lentivirus destaca várias vias motoras na medula espinhal de ratos

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Entrega intra-arterial de células-tronco neurais ao cérebro de ratos e ratos: aplicação à isquemia cerebral

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...