Name: stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord
Uploaded: 2013-03-18T13:00:00
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Damos las gracias a A. Bakhos Tannous, Ph.D., Director de Desarrollo y Producción del vector en el Centro de Neurociencia del Hospital General de Massachusetts en Charlestown, Massachusetts, para que nos proporciona el vector rAAV-EGFP, Whang y Juan de asistencia técnica. Este trabajo recibió el apoyo de subvención R01 NS050408 (a JS) del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares.

El procedimiento quirúrgico descrito ha sido aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Columbia. 1. Preparación de equipos y suspensión de partículas de virus <ol><li> Limpiar y desinfectar el equipo, esterilizar los instrumentos quirúrgicos y los picos de primera categoría V que se utilizan para fijar L1 vértebra. </li><li> Tire y pipetas de cristal biselado. Nosotros usamos pipetas que tienen un diámetro de punta de 40 mi...

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	<li>Lewandoski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+control+of+gene+expression+in+the+mouse.">Conditional control of gene expression in the mouse.</a> Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).</li><li>Couto, L. B., High, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vector-mediated+RNA+interference.">Viral vector-mediated RNA interference.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li><li>Davidson, B. L., Breakefield, X. 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La inyección del vector estereotáxica permite dirigir las neuronas de médula espinal para aplicaciones tales como mapeo de la red neuronal basada en virus transsynaptic propagación 6,7 o disección optogenético 8, guiado de los axones durante la regeneración de lesiones 9,10, o la terapia génica para la prevención o el tratamiento de la neurodegeneración 11, 12. Los vectores virales han sido utilizados para la manipulación de genes en la médula espinal para estudiar...

Las tecnologías avanzadas de manipulación de genes en el ratón condicional permitir que los enfoques multifacéticos para la exploración de las vías sinápticas y las conexiones funcionales en el sistema nervioso central. Los transgenes pueden ser reguladas por efectores de moléculas pequeñas tales como doxiciclina que actúan sobre un transactivador controlado por tetraciclina, que puede ser diseñado para funcionar como un represor o un activador de la transcripción de genes, o tamoxifeno reconociendo un ligando mutado dominio de unión del receptor de estrógeno 1 . Modificación irreversible transgén se consigue comúnmente por el ácido desoxirribonucleico (ADN) recombinasas. Cre (recombinación causas) y FLP (enzima flipasa recombinación) catalizan la escisión, la inversión o translocación de fragmentos de ADN que están flanqueadas por loxP (locus de cruce sobre x, P1) o frontales (objetivo flipasa reconocimiento) los sitios, respectivamente 1. Las aplicaciones incluyen la activación de genes o el silenciamiento y inducible por ácido ribonucleico (ARN) interferencia <sup&gt; 2. Expresión condicional de reporteros fluorescentes o enzimáticos, tales como β-galactosidasa o fosfatasa alcalina se puede utilizar para etiquetar las neuronas y examinar su organización tópica y conectividad 3. Proyectos a gran escala de mutagénesis en América del Norte ( <a href="http://www.norcomm.org/index.htm" target="_blank">http://www.norcomm.org/index.htm</a> ) y Europa ( <a href="http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm" target="_blank">http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm</a> ) están produciendo bibliotecas de clones de embriones de ratón con células madre objetivos condicionales de genes y trampas que eventualmente se cubren todo el genoma del ratón. Los ratones generados a partir de estos clones se pueden cruzar con un número creciente de líneas de ratón que expresan recombinasas de ADN bajo promotores o loci específicos para una población particular de neuronas para la manipulación selectiva de genes ( <a href="http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index.php" target="_blank">http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . php</a> ). <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Sin embargo, la restricción de manipulación génica para diferentes poblaciones de neuronas o regiones particulares de interés no puede lograrse mediante modificación genética dirigida solo si un promotor específico para la población de neuronas de interés no se conoce o no se expresan por todas las neuronas en la región de interés. En la médula espinal, los diseños experimentales pueden requerir restricción espacial de la manipulación genética de uno o dos segmentos craneocaudal. Inyección estereotáxica de un vector viral que expresa Cre o Flp permite limitar la recombinación de genes para las regiones en la médula espinal de ratones en los que los fragmentos de ADN están flanqueados por sitios FRT o loxP, los llamados alelos floxed o flrted. A diferencia de la reordenación del ADN constitutiva, que sería el resultado de cruzamiento de los animales con ratones que expresan recombinasa, esta estrategia también proporciona un control temporal sobre la activación de genes o el silenciamiento. Los vectores virales que codifican floxed o coqueteó transgenes ofrecen una opción inversa de la manipulación genética en ratones que expresan el corresponding aguas abajo de un promotor de recombinasa específica de neuronas. Varios vectores recombinantes con afinidad a las neuronas están disponibles 4. De alta capacidad (gutless) adenovirus, virus adeno-asociados, virus del herpes simple y lentivirus son comúnmente utilizados vectores neurotrópicos. Selección del virus apropiado para una pregunta de investigación es una parte crucial del diseño experimental. Tamaño del transgén, vía de administración, la especificidad de la infección a las neuronas frente a las células gliales, infección de eficacia, los efectos secundarios inflamatorios y tóxicos necesitan ser considerados 4. Aquí se describe la inyección estereotáxica de un vector viral en el asta dorsal de la médula espinal, una técnica que se emplea para la regulación génica condicional en nuestra investigación sobre la neurobiología del dolor. El cuerno dorsal recibe impulsos aferentes primarios de neuronas somatosensoriales incluyendo las neuronas nociceptivas. Interneuronas locales procesar la información antes de transmitirla neuronas de proyección deel cuerno dorsal al cerebro 5. Se demuestra que la infección de las neuronas del asta dorsal a nivel espinal segmentaria L4 con un neurotrópico recombinante adeno-associated virus (rAAV) que expresa aumento de proteína verde fluorescente (EGFP) bajo un promotor de citomegalovirus constitutivamente activo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del Material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td></td></tr><tr><td> Placa base Espinal </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 912 </td><td></td></tr><tr><td> Pequeños animales instrumento estereotáxico </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 900 </td><td></td></tr><tr><td> Gas Ratón anestesia cabeza titular </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 923-B </td><td></td></tr><tr><td> Soportes ajustables de base </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 982 </td><td></td></tr><tr><td> V muesca picos </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 987 </td><td></td></tr><tr><td> Temperatura pequeño sistema de control de animales </td><td> David Kopf Instruments </td><td> TCAT-2LV </td><td></td></tr><tr><td> Adson fórceps </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11006-12 </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps laminectomía </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11223-20 </td><td></td></tr><tr><td> UltraMicroPump (uno) con SYS-Micro4 Controller </td><td> World Precision Instruments </td><td> UMP3-1 </td><td></td></tr><tr><td> Microjeringa 65RN </td><td> Hamilton </td><td> 7633-01 </td><td></td></tr><tr><td> RN accesorio de compresión, 1 mm </td><td> Hamilton </td><td> 55750-01 </td><td></td></tr><tr><td> Vidrio borosilicato capilares </td><td> World Precision Instruments </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microgrinder </td><td> Narishige </td><td> EG-44 </td><td></td></tr></tbody></table>

stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord

Inyección intraparenquimatosa de un vector viral permite la manipulación génica condicional en distintas poblaciones de neuronas o regiones particulares del sistema nervioso central. Se demuestra una técnica de inyección estereotáxica que permite la expresión del gen objetivo o el silenciamiento en el cuerno dorsal de la médula espinal de ratón. El procedimiento quirúrgico es breve. Se requiere laminectomía de una sola vértebra, proporcionando para la recuperación rápida del animal y de la motilidad irreprochable de la columna vertebral. Inyección controlada de un volumen pequeño vector suspensión a baja velocidad y el uso de una microjeringa con cánula de cristal biselado minimizar la lesión del tejido. La respuesta inmune local al vector depende de las propiedades intrínsecas del virus empleados, en nuestra experiencia, es menor y de corta duración cuando un recombinante de virus adeno-asociado se utiliza. Un gen informador tal como la proteína verde fluorescente mejorada facilita la distribución de seguimiento espacial del vector, y la eficacia y la especificidad celularficidad de la transfección.

El éxito de los rendimientos de transfección de expresión génica robusto en las neuronas del asta dorsal de inyección (Figura 1), evitando que el cuerno dorsal del lado contralateral, el cuerno ventral y los ganglios de la raíz dorsal. <img src="/files/ftp_upload/50313/50313fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Transfección de neuronas del asta dorsal. (A) Expresión de la EGFP reportero fluorescente (verde) en el cuerno izquierdo dorsal de la m?...

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Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Los vectores virales permiten la manipulación dirigida de genes. Se demuestra un método para la expresión génica condicional o ablación en la médula espinal de ratón, usando inyección estereotáxica de un vector viral en el asta dorsal, un sitio prominente de contacto sináptico entre las vías aferentes somatosensoriales y las neuronas del sistema nervioso central.

Inyección estereotáxica de un vector viral para la manipulación genética condicional en la médula espinal de ratón

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Médula Espinal Electrofisiología II: Fabricación de electrodos de aspiración extracelular

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Investigación

Neurociencias

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

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Imágenes in vivo de la médula espinal de ratón Utilizando microscopía de dos fotones

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

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La expansión de las células madre embrionarias y adultas neurales por<em&gt; In Utero</em&gt; La electroporación o inyección estereotáxica Viral

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Inyección Viral Intracerebroventricular de Neonatología del ratón Cerebro de transducción neuronal persistente y generalizada

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

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Un procedimiento para el implante Cámara Espinal para Longitudinal<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de la médula espinal de ratón

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

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