Name: investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages
Uploaded: 2013-06-23T14:00:00
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Ce travail a été soutenu par l&#39;American Heart Association (BGIA 7850037 pour Dr. Beiyan Zhou).

1. Isolement de cellules de moelle osseuse <ol><li> Isoler fémur et du tibia os 6-8 semaines vieilles souris, rincer les cheveux et découpées ensuite l&#39;os. </li><li> Utiliser une aiguille 21G et 10 ml seringue pour débusquer osseuse dans PBS froid +2% inactivé par la chaleur du sérum de veau fœtal (FBS) (3-5 ml / souris). </li><li> Passez osseuse à travers une aiguille 21G 4-6 fois de dissocier les cellules. </li><li> Passez cellules à travers un tamis cellulaire um 70 pour enlever des amas de cellules, d...

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	<li>Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microrna+circuitry+links+macrophage+polarization+to+metabolic+homeostasis.">A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis.</a> Circulation. , (2012).</li><li>Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+induces+a+phenotypic+switch+in+adipose+tissue+macrophage+polarization.">Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization.</a> J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).</li><li>Gordon, S., Taylor, P. 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W., Chawla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+m2+activation+of+kupffer+cells+by+ppard+ameliorates+obesity-induced+insulin+resistance.">Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance.</a> Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).</li><li>Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+metabolism+and+pgc-1[beta]+attenuate+macrophage-mediated+inflammation.">Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation.</a> Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+cell-specific+deletion+of+toll-like+receptor+4+ameliorates+hepatic+and+adipose+tissue+insulin+resistance+in+high-fat-fed+mice.">Hematopoietic cell-specific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice.</a> Cell Metab. 10, 419-429 (2009).</li><li>Kang, K., Reilly, S. M., Karabacak, V., Gangl, M. R., Fitzgerald, K., Hatano, B., Lee, C. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte-derived+th2+cytokines+and+myeloid+ppard+regulate+macrophage+polarization+and+insulin+sensitivity.">Adipocyte-derived th2 cytokines and myeloid ppard regulate macrophage polarization and insulin sensitivity.</a> Cell Metabolism. 7, 485-495 (2008).</li><li>Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pparg+activation+primes+human+monocytes+into+alternative+m2+macrophages+with+anti-inflammatory+properties.">Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties.</a> Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).</li><li>Bronte, V., Zanovello, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+immune+responses+by+l-arginine+metabolism.">Regulation of immune responses by l-arginine metabolism.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).</li><li>Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+regulator+of+macrophage+activation:+Mir-223+in+obesity-associated+adipose+tissue+inflammation.">A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation.</a> Circulation. 125, 2892-2903 (2012).</li><li>Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+and+ultrastructural+analysis+of+alveolar+macrophage+maturation.">Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation.</a> J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).</li><li>Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+4+potently+enhances+murine+macrophage+mannose+receptor+activity:+A+marker+of+alternative+immunologic+macrophage+activation.">Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation.</a> J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).</li><li>Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+murine+mononuclear+phagocyte+inflammatory+products+by+macrophage+colony-stimulating+factor.+Lack+of+il-1+and+prostaglandin+e2+production+and+generation+of+a+specific+il-1+inhibitor.">Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor.</a> J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).</li><li>Biswas, S. K., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+interaction+with+lymphocyte+subsets:+Cancer+as+a+paradigm.">Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm.</a> Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+In+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas.</a> J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).</li></ol>

Nous rapportons ici une procédure simple et facilement adaptable in vitro pour induire l&#39;activation des macrophages dérivés de cellules progénitrices de la moelle osseuse. Cette procédure peut être utilisée pour l&#39;étude des mécanismes responsables de la polarisation des macrophages. La pureté des macrophages matures obtenus en utilisant ce protocole moyennes de 95 à 99%, et aucune procédure de purification supplémentaires sont nécessaires. Pour étudier la fonction des gènes spécifiques ...

Distinct de réponses inflammatoires classiques, les macrophages qui infiltrent les tissus manifestant souvent état ​​d&#39;activation polarisée qui joue un rôle crucial dans la régulation des fonctions physiologiques des tissus de l&#39;hôte 1-8. Lors de la stimulation, l&#39;activation des macrophages peut être triée en classique (M1) et alternative (M2) activation 2, 4, 9. L&#39;activation des macrophages M1 dépend de récepteurs Toll-like (TLR) et l&#39;activation du facteur nucléaire kappa B (NFkB) / c-Jun N-terminal kinase 1 (JNK1), conduisant à la production de cytokines inflammatoires, comme le TNF-α et d&#39;IL- 1β et de l&#39;activation de la iNOS qui résulte en une production accrue d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène, comme l&#39;oxyde de nitrure (N) 10, 11. En revanche, M2 recrues d&#39;activation des macrophages PPARy, PPARÔ, ou l&#39;IL-4 STAT6 voies, conduisant à l&#39;activation alternatif, anti-inflammatoire (M2) qui est associée à la régulation positive des récepteurs mannose CD206, et arginase 1 (Arg1) 6, 12 - 14 &lt;/ Sup&gt;. moelle macrophages dérivés d&#39;os (BMDM) présentent un idéal modèle in vitro de comprendre les mécanismes qui contrôlent la polarisation des macrophages activés 15. Plus précisément, l&#39;activation des macrophages M1 peut être induite par les lipopolysaccharides (LPS) stimulation, tandis que la polarisation des macrophages M2 peut être induite par l&#39;IL-4 et / ou de l&#39;IL-13. Moelle osseuse macrophages dérivés matures et les macrophages activés peuvent être identifiés grâce à l&#39;analyse de cytométrie en flux pour l&#39;expression des antigènes de surface, y compris CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 et CD86 9, 16, 17. En outre, des changements dans la production de cytokines et les voies de signalisation cellulaires associés à la polarisation des macrophages peuvent être mesurés par RT-PCR quantitative et Western blot, respectivement. En résumé, la moelle osseuse macrophages dérivés de souris peuvent servir de modèle pertinent pour étudier la polarisation des macrophages in vitro.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IMDM</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH30259.01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal bovine serum</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>10438-026</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Murine GM-CSF</td>
 <td>PeproTech</td>
 <td> 315-03</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NH4Cl</td>
 <td>StemCell Technologies</td>
 <td>7850</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-929</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>CCL-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>70 &mu;m cell strainer</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>352350</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 x PBS</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>AP-9009-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse CD11b-APC</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>17-0112-81</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse F4/80-FITC</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>11-4801-81</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse CD69-PE</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>12-0691-81</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse CD86-PE</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>12-0862-81</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Propidium Iodine</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>P3566</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages

L&#39;article décrit une adaptation facile facile modèle in vitro pour étudier la polarisation des macrophages. En présence de GM-CSF/M-CSF, les cellules souches / progénitrices hématopoïétiques de la moelle osseuse sont dirigés dans la différenciation monocytaire, suivie par la stimulation M1 ou M2. L&#39;état d&#39;activation peut être suivi par des changements dans les antigènes de surface cellulaire, l&#39;expression des gènes et les voies de signalisation cellulaire.

Une description schématique de la procédure de génération BMDM est présentée (figure 1). Haute pureté des macrophages matures peut être observée le jour 7 quand ils représentent 95 à 99% de CD11b + + cellules F4/80 (Figure 2). Macrophages polarisés peuvent être examinés en utilisant des anticorps contre CD11b, F4/80, CD11c et CD206 suivie d&#39;une analyse de cytométrie en flux. Comme le montre la figure 3, les macrophages M1 sont détectés comme CD11b +...

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Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

L&#39;article décrit une adaptation facile facile<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle pour étudier la polarisation des macrophages. En présence de GM-CSF/M-CSF, les cellules souches / progénitrices hématopoïétiques de la moelle osseuse sont dirigés dans la différenciation monocytaire, suivie par la stimulation M1 ou M2. L&#39;état d&#39;activation peut être suivi par des changements dans les antigènes de surface cellulaire, l&#39;expression des gènes et les voies de signalisation cellulaire.

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The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

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